從人們首次發(fā)現(xiàn)反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotides， ASOs)具有干擾mRNA和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)的性能，到最近FDA批準(zhǔn)一款治療脊髓性肌萎縮的ASOs藥物，這期間經(jīng)歷了近40年的漫長積淀。
在早期研究階段，ASOs存在靶向性不強(qiáng)、生物活性不足、脫靶毒副作用等諸多短板，而今，一些經(jīng)化學(xué)修飾ASOs的出現(xiàn)很好地解決了上述問題，隨著對ASOs作用機(jī)制的深入研究，以及大規(guī)模更具針對性臨床試驗的開展，制藥行業(yè)逐漸掀起一股ASOs研發(fā)熱。
目前，很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病缺乏有效的藥物干預(yù)手段，這些疾病是ASOs治療策略的理想實踐平臺。近幾年，用于治療杜氏肌營養(yǎng)不良、脊髓性肌萎縮的ASOs藥物先后獲FDA批準(zhǔn)上市，可以看作ASOs在這一領(lǐng)域“里程碑式”的開拓。
化 學(xué) 修 飾
反義寡核苷酸是指與靶基因mRNA互補(bǔ)的一段單鏈DNA或RNA序列，通常由十幾到幾十個堿基組成，通過化學(xué)合成的方式生產(chǎn)。不經(jīng)修飾的ASOs不論在體液內(nèi)還是細(xì)胞中都極易被降解，不能發(fā)揮其反義作用。而經(jīng)化學(xué)修飾的ASOs，顯著提高了其成藥性。目前ASOs基本骨架常見的幾種化學(xué)修飾方式如圖1所示。
其中硫代寡核苷酸(phosphorothioate)、混合骨架寡核苷酸(mixed backbone oligonucleic acid)和多肽核酸(peptide nucleic acid)應(yīng)用廣泛，成為具有代表性的第一、二、三代ASOs。
由于磷酸二酯鍵是核酶的主要靶點，因此采用硫化試劑將ASO磷酸二酯鍵硫化，形成硫代寡核苷酸，是增強(qiáng)ASO穩(wěn)定性的有效途徑。硫代寡核苷酸是迄今研究最深入、應(yīng)用最廣泛的結(jié)構(gòu)。作為第一代ASO，硫代寡核苷酸具有良好的水溶性、穩(wěn)定性及易于大量合成，半衰期也更長，基本能滿足臨床治療的需要。核糖取代物，包括2'-甲基（2'-OMe），2'-甲氧基乙基（2'-MOE）和鎖定的核酸(locked nucleic acid)，經(jīng)常被用于進(jìn)一步增加穩(wěn)定性、靶向性，并且通常具有更少的**。
混合骨架寡核苷酸是人們根據(jù)不同修飾的ASO特性而加以各種組合設(shè)計而成。與硫代寡核苷酸相比，混合骨架寡核苷酸通過不同化學(xué)修飾的組合降低了硫代磷酸二酯鍵的數(shù)量，減少了自身攜帶的負(fù)電荷，降低了體內(nèi)降解速度并改變了核酸降解物的種類，從而減少了由硫代導(dǎo)致的副反應(yīng)。比如，phosphorodiamidate morpholino (PMO)，其中脫氧核糖骨架被一個嗎 啡環(huán)取代，而帶電的磷酸二酯間鏈則被一個無電荷的磷胺基鏈取代。
多肽核酸（PNA）是以2-氨基乙基甘氨酸為基本單元，堿基通過一個甲基羰基與類肽鏈骨架相連。體外試驗證明，PNA與RNA結(jié)合可抑制逆轉(zhuǎn)錄過程，與雙鏈DNA發(fā)生鏈侵入反應(yīng)后，可有效阻斷限制性內(nèi)切酶對酶切位點的識別和切割，從而阻斷蛋白的表達(dá)。與前兩代ASO相比，PNA具有更強(qiáng)的親和力及更好的特異性，往往更短的片段即可獲得相同的反義效果；具有良好的蛋白酶和核酸酶抗性，在細(xì)胞培養(yǎng)液及體內(nèi)不易降解，半衰期更長；經(jīng)修飾后具有良好的細(xì)胞膜穿透性，其應(yīng)用前景廣闊。
藥 效 機(jī) 理
對反義寡核酸進(jìn)行某些特定而合適的化學(xué)修飾后，其通過一定方式進(jìn)入細(xì)胞，能夠特異性地調(diào)控靶基因的表達(dá)。其作用機(jī)制是：1. 反義寡核苷酸與靶mRNA結(jié)合形成DNA- RNA雜合分子，可以激活RNase H，該酶可以切割雜合分子中的RNA鏈，導(dǎo)致靶mRNA降解。2. 不能激活RNase H活性的反義寡核苷酸可以通過空間位阻效應(yīng)阻止核糖體結(jié)合來抑制靶mRNA的翻譯；另外還可以通過封閉剪接位點有選擇的促進(jìn)蛋白某個可變剪接體的表達(dá)，從而糾正錯誤的剪接。如圖2所示。
臨 床 試 驗
自1970s以來，ASOs的治療作用就被寄予厚望，但經(jīng)過幾十年的成藥性研究，ASOs才得以進(jìn)入臨床試驗階段。當(dāng)前ASOs在神經(jīng)系統(tǒng)疾病開展的臨床試驗如表1所示。
杜氏營養(yǎng)不良癥的治療研究主要借助于ASOs的剪接調(diào)節(jié)（Splicing modulation）作用；采用皮下或靜脈注射的給藥方式；靶向基因主要集中在DMD (exon 45)、DMD (exon 51)、DMD (exon 53)；ASO普遍采用2′-OMe、PMO等化學(xué)修飾手段；臨床試驗主要集中在II、III階段。
脊髓性肌萎縮、家族性淀粉樣變性多神經(jīng)病、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良等的治療研究主要借助于ASOs的RNase H調(diào)節(jié)降解（RNase H-mediated degradation）作用；采用皮下或靜脈注射的給藥方式；靶向基因分別為SMN2、TTR、HTT、SOD1、CD49d、DMPK；ASO普遍采用2′MOE-PS化學(xué)修飾手段；臨床試驗主要集中在I、II階段。其中，在2016年12月被FDA批準(zhǔn)用于治療SMA的nusinersen，代表了一個典型的臨床研究案例。
結(jié) 語
隨著分子化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，ASOs的分子結(jié)構(gòu)將更加優(yōu)化，從而提高反義分子被細(xì)胞攝取的速率及程度，提高靶向性，穩(wěn)定性，降低**。近來，治療DMD的eteplirsen和治療SMA的nusinersen分別獲批上市，為ASOs應(yīng)用于病理機(jī)制清晰的神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定了基礎(chǔ)。隨著越來越多臨床試驗的開展，ASOs療法或許會重塑很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療前景。
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