在一項(xiàng)新的研究中，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所的饒子和（Zihe Rao）院士、Quan Wang研究員、孫飛（Fei Sun）研究員及其同事們分離出恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis）的呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物（respiratory supercomplex），并且利用低溫電鏡（cryo-EM）技術(shù)在3.5 ?的分辨率下可視化觀察它的三維結(jié)構(gòu)。這種細(xì)菌與結(jié)核分枝桿菌存在著密切的親緣關(guān)系，而且是一種用于研究許多細(xì)菌物種的流行模型。這種詳細(xì)的結(jié)構(gòu)揭示出電子如何在一種迄今為止觀察不到的過(guò)程中在細(xì)胞內(nèi)傳遞。相關(guān)研究結(jié)果于2018年10月25日在線發(fā)表在Science期刊上，論文標(biāo)題為“An electron transfer path connects subunits of a mycobacterial respiratory supercomplex”。
通常，在細(xì)胞呼吸期間，能量來(lái)源（糖、脂肪酸和氨基酸）的氧化與電子受體（氧氣、硫、硝酸鹽和硫酸鹽）的還原偶聯(lián)在一起，從中可獲得化學(xué)能來(lái)合成三磷酸腺苷（ATP）和驅(qū)動(dòng)細(xì)胞反應(yīng)。在有氧細(xì)胞呼吸中，這種化學(xué)能的產(chǎn)生方式是當(dāng)電子供體通過(guò)電子傳遞鏈（electron transport chain, ETC）傳遞到末端電子受體時(shí)產(chǎn)生一種稱(chēng)為質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)（proton motive force, PMF）的跨膜質(zhì)子梯度，這種質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)可驅(qū)動(dòng)ATP合成。在這項(xiàng)新的研究中，這些研究人員揭示了酶之間的電子傳遞存在直接關(guān)聯(lián)性，這代表著一種新的呼吸鏈催化模式。
醌和細(xì)胞色素是電子傳遞鏈中的兩種類(lèi)型的電子載體，用于在嵌于膜中的較大的大分子結(jié)構(gòu)之間傳遞電子。四種膜氧化還原酶參與線粒體呼吸鏈的電子傳遞。它們包括復(fù)合物I（NADH:泛醌氧化還原酶, CI），復(fù)合物II（琥珀酸:泛醌氧化還原酶, CII），復(fù)合物III（bc1型泛醇;細(xì)胞色素c氧化還原酶，bc1型CIII）和復(fù)合物IV（aa3型細(xì)胞色素c氧化酶，aa3型CIV）。從功能上說(shuō)，復(fù)合物CIII能夠?qū)⒎捍佳趸煞乎㈦娮觽鬟f給可溶性的細(xì)胞色素c。電子隨后被傳遞到復(fù)合物CIV，在那里氧氣被還原成水。跨膜PMF通過(guò)復(fù)合物CI、CIII和CIV中的質(zhì)子泵浦產(chǎn)生。
在原核生物的呼吸鏈中，情況更為復(fù)雜。由于這種復(fù)雜性，尚未在原核生物的細(xì)胞中確定完整的電子傳遞途徑。因此，有必要了解參與細(xì)菌電子傳遞的一種呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物的完整結(jié)構(gòu)。在這項(xiàng)新的研究中，這些研究人員從恥垢分枝桿菌中提取出并純化了這種呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物，并利用低溫電鏡技術(shù)在3.5 ?的分辨率下可視化觀察它的結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)為揭示這種呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物中的電子直接傳遞機(jī)制提供了重要的見(jiàn)解。這種呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物的尺寸在200×70×120 ?的范圍內(nèi)，以一種對(duì)稱(chēng)的線性結(jié)構(gòu)存在著，這完全不同于之前報(bào)道的呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物。從組成上來(lái)說(shuō)，線性的CIV1-CIII2-CIV1二聚體如此排列著以至于單個(gè)復(fù)合物CIV1位于中央的復(fù)合物CIII2二聚體的兩側(cè)。這種信息揭示了在電子傳遞過(guò)程中酶之間存在著直接的關(guān)聯(lián)性，這代表著一種新的呼吸鏈催化模式。這種詳細(xì)的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)有潛力協(xié)助開(kāi)展抵抗分枝桿菌的藥物發(fā)現(xiàn)工作。
在細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)期間，這些研究人員使用類(lèi)似于結(jié)核分枝桿菌的過(guò)氧化氫抵抗性恥垢分枝桿菌突變株。培養(yǎng)這些細(xì)菌細(xì)胞，隨后按照之前描述的方法（Microbiology, 2006, 152:823-829, doi: 10.1099/mic.0.28723-0）分離它們的細(xì)胞膜。在細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)、收集和裂解后，收集它們的細(xì)胞膜沉淀，接著提取出細(xì)胞膜中的呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物。他們隨后利用光譜學(xué)方法、質(zhì)譜法和3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色法描述了這種呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物的特征。為了鑒定出血紅素基團(tuán)，按照之前的方法（Journal of Biological Chemistry, 2015, doi:10.1074/jbc.M114.624312），他們?cè)谶B二硫酸鹽還原之前和之后通過(guò)記錄光譜來(lái)分析所選的部分樣品。他們使用天然質(zhì)譜法分析純化的呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物樣品以便研究它的結(jié)構(gòu)，并且使用之前建立的實(shí)驗(yàn)方法分析這種呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物中的單個(gè)結(jié)構(gòu)組分。
在低溫電鏡分析期間，這些研究人員使用乙酸雙氧鈾（1％, w/v）對(duì)5μl的濃度為0.05 mg/ml的恥垢分枝桿菌呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物樣品進(jìn)行負(fù)染色，隨后利用在120kV下運(yùn)行的FEI Tecnai Spirit顯微鏡上拍攝圖片用于初始的結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建。他們通過(guò)處理來(lái)自負(fù)染色的呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物樣品的53張顯微圖片，重建出這種呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物的低分辨率結(jié)構(gòu)。為了完全重建這種呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，他們?cè)诘蜏仉婄R圖片處理期間從8200張?jiān)紙D片中手工選擇出7600張。這項(xiàng)研究中的所有圖片都是利用PyMOL或UCSF chimera構(gòu)建出來(lái)的。
這些研究人員揭示出恥垢分枝桿菌CIII-CIV呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物的低溫電鏡結(jié)構(gòu)。這種呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物內(nèi)部的電子傳遞途徑的范圍從復(fù)合物CIII中的醌醇（quinol）氧化到復(fù)合物CIV中的氧氣還原。這些研究結(jié)果顯示了一種新的分叉電子傳遞機(jī)制，從而確保完成醌循環(huán)（Q cycle, 即質(zhì)子穿過(guò)脂質(zhì)雙層的凈運(yùn)動(dòng)）而實(shí)現(xiàn)能量轉(zhuǎn)換。氧化物歧化酶（SOD）直接參與這種呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物的組裝，能夠讓它免受活性氧（ROS）的氧化損傷。醌結(jié)合位點(diǎn)的分布也為在未來(lái)開(kāi)發(fā)基于結(jié)構(gòu)的抗微生物藥物提供了一種框架。
參考資料：Hongri Gong1,*, Jun Li2,3,*, Ao Xu et al. An electron transfer path connects subunits of a mycobacterial respiratory supercomplex. Science, Published Online: 25 Oct 2018, doi:10.1126/science.aat8923.
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