早些時候，藥物發(fā)現(xiàn)主要依賴于偶然的現(xiàn)象和臨床醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)，現(xiàn)代藥物開發(fā)的篩選模式最初始于Paul Ehrlich對抗梅毒 藥物的系統(tǒng)化篩選，經(jīng)過多年的發(fā)展，目前的篩選模式和方法早已發(fā)生了巨大的變化，但系統(tǒng)篩選這一核心思想?yún)s并未改變。受限于生物技術(shù)的發(fā)展水平，早些時候藥物篩選主要依賴于表型篩選模式，而且每次可以篩選的化合物數(shù)量較少。隨著生物科技的快速發(fā)展，PCR、DNA重組、轉(zhuǎn)染等技術(shù)的出現(xiàn)，極大的促進(jìn)了藥物篩選的效率。伴隨著新技術(shù)的出現(xiàn)，篩選數(shù)據(jù)的數(shù)量和復(fù)雜程度也直線上升，在規(guī)范化的研發(fā)模式中，藥物開發(fā)分工也越來越細(xì)化，負(fù)責(zé)化合物優(yōu)化的藥物化學(xué)家可能并沒有相關(guān)的生物學(xué)或者分子生物學(xué)背景，因此對化合物篩選中的一些數(shù)據(jù)或者術(shù)語有清晰的認(rèn)知和了解，對化合物的優(yōu)化非常有必要。

       篩選的類型

       目前化合物的篩選主要有兩種模式：表型篩選和基于靶點(diǎn)的藥物篩選！這兩種篩選思路各有優(yōu)劣，總體上呈互補(bǔ)關(guān)系?；诎悬c(diǎn)的藥物篩選主要用于靶點(diǎn)-疾病相互作用明確，將靶點(diǎn)蛋白通過現(xiàn)代生物技術(shù)制備出來，然后測試其與待測化合物的相互作用強(qiáng)弱，這種方法的優(yōu)點(diǎn)是效率高、化合物作用原理清晰，但是前期需要大量的投入以確證目標(biāo)靶點(diǎn)與疾病的相互關(guān)系。表型篩選通常以細(xì)胞作為篩選工具，優(yōu)點(diǎn)是對于靶點(diǎn)還不明晰，或靶點(diǎn)與疾病之間的關(guān)系還不明確時的藥物開發(fā)，具有非常好的效果，常用于First in class藥物的研發(fā)，缺點(diǎn)在于作用機(jī)制不明晰，因此后期還需要復(fù)雜的機(jī)制研究。表型篩選盛行于藥物開發(fā)的早期階段，但是現(xiàn)在越來越多的制藥公司對這一方法青睞有加，主要是因?yàn)樗谛路f藥物開發(fā)中表現(xiàn)出來的巨大優(yōu)勢。

       化合物的篩選是一項(xiàng)復(fù)雜的過程，會產(chǎn)生很多數(shù)據(jù)，對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行有效的辨識和分析，是項(xiàng)目成功的重要條件，以下對幾種比較重要的數(shù)據(jù)做一簡要介紹。

       濃度-響應(yīng)曲線和IC50

       在開始篩選時，通常會設(shè)置一個固定的濃度或者數(shù)值，比如說對于給定作用靶點(diǎn)，半數(shù)抑制濃度要小于1 uM，這樣去除大部分效果差或者沒有效果的化合物，將通過初篩的化合物，再重復(fù)測試若干個不同濃度下的響應(yīng)數(shù)據(jù)，通常為8到12個1/2Log（濃度）梯度，將得到的濃度-響應(yīng)信號強(qiáng)度連成一條曲線，就得到了化合物的濃度響應(yīng)曲線，根據(jù)此曲線可以判斷評價各個化合物。

       在化合物樣本量較小的時候，可以采用濃度響應(yīng)曲線來評價化合物的活性，但是當(dāng)化合物的數(shù)量很多的時候，繪制濃度響應(yīng)曲線是不可能的，工作量太大，此時通常采用半數(shù)抑制濃度IC50。IC50是指抑制劑（酶拮抗劑、受體）將給定刺激所產(chǎn)生效應(yīng)減小一半時的濃度，這個數(shù)值的意義由活性測試本身所確定，比如說基于酶活性的測試，IC50表示化合物對酶活性的抑制效果；如果是GPCR的活性測試中，只是表示化合物對GPCR**標(biāo)記配體的取代效果，并不代表其產(chǎn)生的生理活性。另外，測試條件，如底物/配體濃度、輔因子濃度以及初始刺激強(qiáng)度等也會影響結(jié)果，因此，對于IC50這個數(shù)值的理解，要根據(jù)具體的測試條件以及數(shù)據(jù)采集方式來定。

       “常數(shù)”類指標(biāo): Kd 、Ki、KB、KA、Km

       雖說IC50是一個非常重要的化合物活性比較工具，但是仍然有局限性，帶有一定的經(jīng)驗(yàn)性，而且不能體現(xiàn)化合物與靶點(diǎn)生物大分子結(jié)合能力的強(qiáng)弱，這時需要引入一個新的參數(shù)：化合物解離常數(shù)K，化合物解離常數(shù)的定義是：測試體系中【配體的濃度】與【蛋白濃度】乘積除以體系中的【靶點(diǎn)-化合物結(jié)合物】的濃度，其意義為半數(shù)靶點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)被化合物結(jié)合時，所需要的化合物濃度，常數(shù)K濃度越低，則表明化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合性越強(qiáng)，反之則越弱。需要注意的是，所有的平衡解離常數(shù)K值均帶有濃度單位，

       在實(shí)際應(yīng)用中，分別以不同的下標(biāo)來表示不同的測試。Kd表示采用**標(biāo)記配體與靶點(diǎn)結(jié)合的平衡解離常數(shù)。KB表示在拮抗劑-受體復(fù)合物的平衡解離常數(shù)，在效能測試中測定，表示對生理反應(yīng)的拮抗作用。KA表示激動劑-受體復(fù)合體的平衡解離常數(shù)。Ki則表示在生化結(jié)合測試中或酶測試中拮抗劑-受體復(fù)合物的平衡解離常數(shù)。Km全稱為米歇利斯常數(shù)，也稱為米氏常數(shù)，通常用于表示反應(yīng)速率為值Vmax一半時，底物的濃度，常用于衡量底物對酶的結(jié)合性。

       結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Bmax

       理想模型下，化合物與靶點(diǎn)分子的結(jié)合位置僅有一個，然而實(shí)際情況并非如此。將目標(biāo)受體膜或組織在不同濃度的**配體環(huán)境下培養(yǎng)一段時間后，過濾除去未結(jié)合的配體，將已結(jié)合的與自由配體的比值（bound/free）為縱坐標(biāo)，結(jié)合配體的數(shù)目（bound）為橫坐標(biāo)，得到一條直線，稱之為Scatchard作圖（Scatchard plot），其斜率為平衡解離常數(shù)的負(fù)倒數(shù)，與橫坐標(biāo)的截距則為單位質(zhì)量的組織或蛋白的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目Bmax。然后將**標(biāo)記的配體替換為待測化合物，重復(fù)同樣的操作，得到另外一條曲線，若Bmax保持不變，而直線的斜率減小，則表示待測化合物為競爭性作用。當(dāng)直線的斜率不變而Bmax減小，則表示待測化合物為非競爭性作用。

       半效能濃度與效能：EC50 & Emax

       IC50、平衡解離常數(shù)K并不能表示待測化合物所產(chǎn)生的生理反應(yīng)情況，例如在GPCR的體外測試中，這些數(shù)值只是表明該化合物將GPCR受體結(jié)合位點(diǎn)上天然配體取代掉能力的強(qiáng)弱，并不能體現(xiàn)使GPCR受體產(chǎn)生相應(yīng)生物效應(yīng)能力的情況，因此還需要對化合物做功能測試，和濃度-響應(yīng)曲線的測試方法類似，通常選取8到12個濃度梯度，每個濃度1/2Log（濃度）差異，對于GPCR受體來說，一般通過測定第二信使的濃度來研究化合物的效能，通常，以天然配體與靶點(diǎn)結(jié)合后產(chǎn)生的效果表示為效能，待測化合物的效能可能大于也可能小于天然配體，將產(chǎn)生效應(yīng)一半時的濃度，稱為EC50，將產(chǎn)生的效應(yīng)與天然配體所產(chǎn)生效應(yīng)的比值稱為效能Emax。值得注意的是，在不清楚化合物的效能Emax時，僅使用EC50來比較化合物的活性情況是毫無意義的。上圖（圖六）中化合物2和天然配體的EC50值一樣，而且化合物1的EC50值比天然配體的還要高，但不管化合物1還是化合物2，它們所能產(chǎn)生的效能均沒有天然配體的高。

       激動劑、部分激動劑、拮抗劑、變構(gòu)調(diào)節(jié)劑以及反向激動劑

       通常來說，對于簡單的靶點(diǎn)，化合物的作用效果比較單一，也較容易理解，如酶腸肽酶、糖苷水解酶等，僅表現(xiàn)為抑制作用，但是對于比較復(fù)雜的靶點(diǎn)，如GPCR、核受體等，涉及到一系列的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，化合物所表現(xiàn)出來的效果各有差異，相對于天然的配體，化合物所產(chǎn)生的生物效果可能比天然配體的效果強(qiáng)，也可能比較弱，也可能阻斷下游信號通路，因此，對于上述幾種作用結(jié)果，可分為激動劑、部分激動劑、拮抗劑、變構(gòu)調(diào)節(jié)劑以及反向激動劑等幾種。

       將能夠引起和天然配體一樣效應(yīng)的化合物稱之為激動劑，對于雖然能夠產(chǎn)生和天然配體一樣效應(yīng)的化合物，但是其效果并沒有天然配體的效果強(qiáng)，稱之為部分激動劑。對于那些既不會產(chǎn)生激動效應(yīng)、也不會產(chǎn)生抑制效應(yīng)，但是能夠和靶點(diǎn)相結(jié)合、結(jié)合能力比天然配體強(qiáng)的化合物，稱之為中性激動劑，需要了解的是，雖然中性激動劑不會產(chǎn)生正面或者負(fù)面的效應(yīng)，但是它占據(jù)了結(jié)合位點(diǎn)，因而表現(xiàn)出“沉默效應(yīng)”，也稱之為拮抗劑。

       靶點(diǎn)生物大分子并不是想象中的只有“開”和“關(guān)”兩種狀態(tài)，本質(zhì)上，這些系統(tǒng)處于一個平衡中，以GPCR為例來說明：當(dāng)未有天然配體或者激動劑存在時，一部分GPCR受體于激活狀態(tài)時的構(gòu)象，而一部分在表現(xiàn)為靜息狀態(tài)下的構(gòu)象，只不過靜息狀態(tài)的構(gòu)型處于主導(dǎo)地位，但絕不是全都是靜息狀態(tài)，此時所表現(xiàn)出來的活性稱之為“基底活性（BasalActivity）”，加入激動劑后，使得該平衡中處于激活狀態(tài)的受體數(shù)量增加，總體上表現(xiàn)出激活作用；當(dāng)加入的化合物能夠穩(wěn)定GPCR的靜息構(gòu)型，平衡中處于靜息狀態(tài)的受體數(shù)量增加，表現(xiàn)出與激活狀態(tài)時相反的效應(yīng)，那么就稱該化合物為“反向激動劑”。

       調(diào)節(jié)靶點(diǎn)（生物大分子）性質(zhì)最直接的方式就是設(shè)計出合適的化合物，與靶點(diǎn)上天然配體相結(jié)合的位置相互作用，而這個位置稱之為正構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)，但是也存在其他的結(jié)合位點(diǎn)，通常該位點(diǎn)和正構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)相距較遠(yuǎn)，小分子化合物與該位點(diǎn)結(jié)合，能夠改變靶點(diǎn)分子的構(gòu)象，增強(qiáng)靶點(diǎn)功能的化合物稱為正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，反之則稱為負(fù)向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑。在很多情況下，如果缺失配體，僅有變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的存在不會影響生物系統(tǒng)的功能，以GPCR為例說明，當(dāng)有正向變構(gòu)劑存在時，能夠促進(jìn)配體與GPCR受體的結(jié)合，從而產(chǎn)生相應(yīng)的調(diào)節(jié)響應(yīng)，但是如果沒有配體存在，僅有變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，則GPCR受體不能被激活。苯二氮卓類藥物就屬于伽馬氨基丁酸受體變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，目前已有30多種苯二氮卓類藥物，廣泛用于焦慮、驚慌癥、失眠等疾病的治療。

       儲備受體

       一般我們都會認(rèn)為，受體和下游的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)存在著一一對應(yīng)關(guān)系，按照此假設(shè)，如果想要產(chǎn)生的信號響應(yīng)，則需要將細(xì)胞表面的受體全部激活才行，然而事實(shí)并非如此，實(shí)際上細(xì)胞表面的受體僅需被激活一部分，就能達(dá)到的信號響應(yīng)，此時，胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)已達(dá)到飽和狀態(tài)，因此，被激活受體的百分比相比實(shí)際的數(shù)量更有意義，舉例來說，假如在不同的組織細(xì)胞表面表達(dá)了同一種受體，但是其中一個組織的細(xì)胞（A細(xì)胞）表面受體表達(dá)數(shù)量較另一個（B細(xì)胞）更多，在同樣的配體濃度下，B細(xì)胞表面約十分之一的受體被激活，而A細(xì)胞表面則僅有百分之一的受體被激活，此時A細(xì)胞僅能產(chǎn)生較小的細(xì)胞響應(yīng)，而B細(xì)胞則表現(xiàn)出的響應(yīng)，由此，可以選擇性的激活B而使A處于沉默狀態(tài)，但如果目標(biāo)調(diào)節(jié)是A，則B細(xì)胞就會不可避免的被激活。如果采用受體過表達(dá)的細(xì)胞做體外篩選，得到的化合物在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時，其活性會比體外測試的更強(qiáng)，因?yàn)檎＜?xì)胞表面的受體含量遠(yuǎn)低于篩選模型細(xì)胞。

       總結(jié)

       化合物的體外篩選是藥物開發(fā)最起始也是非常重要的一個階段，“讀懂”測試數(shù)據(jù)是決策的基本條件，只有各個指標(biāo)在一個合理的區(qū)間內(nèi)才具有進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化的價值。