免疫療法是當(dāng)下腫瘤治療領(lǐng)域前景的發(fā)展方向之一。隨著PD-(L)1等免疫檢查點抑制劑應(yīng)用范圍逐漸擴大，CAR-T療法研究不斷出現(xiàn)新的進展，CAR-T療法作為有別于傳統(tǒng)藥物的“活藥”，不僅對復(fù)發(fā)、難治性腫瘤患者表現(xiàn)出了突破性療效，其生產(chǎn)體系和使用場景也有別于普通藥物。鑒于當(dāng)下生物技術(shù)的更新速度，預(yù)計CAR-T療法還將帶給市場更多驚喜。本報告擬從CAR-T療法技術(shù)基礎(chǔ)入手，分析CAR-T療法的局限性及研發(fā)方向、行業(yè)發(fā)展情況、研發(fā)情況與如何選擇國內(nèi)標(biāo)的、投融資情況及行業(yè)總結(jié)。

      一、CAR-T的靶向抗原

      CAR-T技術(shù)是靶向某一種抗原，而不是針對單一腫瘤疾病，因此靶點的選擇是CAR-T有效性和安全性的基礎(chǔ)。CAR-T靶向的腫瘤抗原可分為兩類：

      腫瘤特異性抗原：特異性地在腫瘤細胞表面表達，在正常組織中無表達，這是最理想的抗原。靶點抗原的特異性越高，CAR-T細胞就可越專一地針對特定的腫瘤細胞，對正常細胞不作用，從而降低機體不良反應(yīng)。這種理想的抗原并不多，目前受到關(guān)注的有表皮生長因子受體EFGRvIII和前列腺特異性膜抗原PSMA等。

      腫瘤相關(guān)抗原：在腫瘤細胞表面過度表達，在正常組織中低表達，目前大部分應(yīng)用的腫瘤抗原靶點都是這種；腫瘤相關(guān)抗原可分為幾種不同類型：免疫細胞的抗原通常與其抗原分化簇（CD）分型有關(guān)，包括CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD269（BCMA）等；參與生長和分化信號的抗原，包括癌胚抗原（CEA）、表皮生長因子受體（EGFR、HER2）、酪氨酸激酶受體（EPHA2）等；參與腫瘤血管生成的抗原，包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、VEGF受體（VEGFR）等；腫瘤支撐結(jié)構(gòu)的腫瘤間質(zhì)和細胞外基質(zhì)抗原，包括纖維細胞激活蛋白（FAP）、tenascin蛋白等。

      從研發(fā)進展來看，應(yīng)用于臨床最成功的案例是以CD19為靶點構(gòu)建的CAR-T（此前諾華和Kite Pharma獲批的兩個CAR-T 產(chǎn)品均以CD19為靶點），主要有兩方面的原因，一方面，CD19抗原雖然是腫瘤相關(guān)抗原，但是它只在正常的B細胞和腫瘤B細胞上表達，以CD19為靶點的CAR-T會殺傷所有B細胞，當(dāng)B細胞都被殺死之后，造血干細胞可以補充新的正常B細胞，患者也可以通過輸入免疫球蛋白來補償正常B細胞損傷所產(chǎn)生的影響，因此即使清除了患者體內(nèi)的B細胞，通常也不會對患者的健康產(chǎn)生嚴重影響；另一方面，回輸?shù)腃AR-T細胞自然歸巢于血液器官，如血液、骨髓和淋巴結(jié)等，CAR-T與B細胞接觸充分，有效作用殺傷。雖然以CD19為靶點的CAR-T細胞治療效果很好，但是其適應(yīng)癥也局限在B細胞相關(guān)的血液腫瘤中，比如B系淋巴細胞白血?。毙?、慢性）以及非霍奇金淋巴瘤（彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤等）。

      除了靶點CD19，BCMA、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123等靶點的開發(fā)均逐漸把CAR-T拓展到更廣泛的血液腫瘤治療上。這些靶點中，BCMA正在成為CAR-T治療的熱門靶點。BCMA作為一種極為重要的B細胞生物標(biāo)志物，之所以引起極大關(guān)注，是因為它的RNA幾乎總是在多發(fā)性骨髓瘤細胞中發(fā)現(xiàn)，并且該蛋白也存在于多發(fā)性骨髓瘤患者惡性漿細胞表面，而且，與CD19靶點類似，BCMA-CAR-T治療后雖然也殺傷了正常的漿細胞，但患者可以通過免疫球蛋白給藥來維持機體免疫力。雖然目前尚無相關(guān)產(chǎn)品獲批上市，但在臨床試驗中，靶向BCMA的CAR-T療法用于多發(fā)性骨髓瘤的治療已經(jīng)獲得了很大的成功。美國bluebird bio和南京傳奇生物的靶向BCMA治療多發(fā)性骨髓瘤的CAR-T產(chǎn)品在臨床試驗中均達到了較高的客觀緩解率（bluebird： 94%，南京傳奇：）。

      實體瘤靶點的研發(fā)較為困難，主要是因為以下三點：第一，幾乎所有的靶點都是腫瘤相關(guān)抗原，CAR-T細胞在殺傷腫瘤細胞時容易誤傷正常組織，發(fā)生“脫靶**”；第二，實體瘤是一群異質(zhì)性腫瘤細胞，不同突變腫瘤細胞上的靶點不一樣，單一種類的CAR-T很難殺光全部腫瘤細胞；第三，實體腫瘤就像獨立的器官一樣，擁有自己的血管、淋巴管、結(jié)締組織等，周圍的溫度、pH、滲透壓、細胞因子等微環(huán)境都與正常組織不一樣，正常的免疫細胞以及CAR-T等都可能會被腫瘤微環(huán)境所抑制，不能發(fā)揮免疫反應(yīng)。

      2018年中國腫瘤登記年報數(shù)據(jù)顯示，我國發(fā)病率的前10種癌癥均為實體瘤，占全部癌癥的比例高達77%。2017年美國癌癥年報數(shù)據(jù)也顯示，每年新增癌癥病例中僅有不到5%的比例是血液腫瘤。因此，CAR-T實體瘤靶點的研發(fā)空間還非常巨大，任重道遠。

      據(jù)Cell Trials的統(tǒng)計，截至2017年10月，全球大約50%的 CAR-T臨床試驗針對CD19靶向抗原，另有一小部分（約6%）使用的是由CD19與另一抗原組成的組合抗原。除卻CD19，CAR-T在血液腫瘤治療方面還有許多其他抗原，其中BCMA、CD22、CD20較為常見。

      在實體瘤治療方面，以間皮素（Mesothelin）為靶點的CAR-T臨床試驗數(shù)量暫時處于領(lǐng)先地位。作為一個潛在的良好靶點，間皮素在實體瘤細胞中大量表達，但在正常組織中的表達水平卻很低。實驗數(shù)據(jù)顯示，間皮素在間皮瘤、胰 腺癌和肺癌細胞表面均有表達。緊隨其后，針對磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）靶點治療肝癌、雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂2（GD2）靶點治療神經(jīng)母細胞瘤以及針對CEA靶點治療腸癌的CAR-T療法也受到了廣泛關(guān)注。

      二、CAR-T結(jié)構(gòu)中抗體scFv的篩選

      CAR是以抗體的scFv（單鏈可變區(qū)）識別腫瘤抗原的。因此，與單抗的研發(fā)路徑類似，CAR-T的研發(fā)也需要獲取和篩選單抗。雜交瘤技術(shù)是獲取單抗的基礎(chǔ)，該技術(shù)可獲得相應(yīng)的分泌單抗的雜交瘤細胞。篩選出親和力高的單抗后，將相應(yīng)的雜交瘤細胞凍存?zhèn)鞔纬煞€(wěn)定的細胞株，用于CAR結(jié)構(gòu)中scFv序列的構(gòu)建。

      scFv由重鏈、輕鏈以及之間的linker連接而成，所以將不同的重鏈和輕鏈隨機組合，可以建成人源化的scFv組合抗體文庫，再通過表達量、穩(wěn)定性、與抗原的親和力等指標(biāo)進行篩選。如果收集攜帶特定腫瘤抗原的患者外周血B淋巴細胞（比如30-100例），通過提取其中的mRNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，也可以作為全人源抗體庫的素材。

      高通量篩選主要通過噬菌體展示技術(shù)。簡單來說，噬菌體展示技術(shù)是將外源的抗體基因與噬菌體衣殼蛋白基因融合，以融合蛋白的形式呈現(xiàn)在噬菌體的表面。這個技術(shù)優(yōu)點是直接將表達出來的抗體與其基因型聯(lián)系在一起，再利用抗原—抗體的特異性結(jié)合，將感興趣的抗體挑選出來。通過噬菌體技術(shù)，可高效的獲得scFv人源化片段，提高CAR-T的安全性和有效性。

      scFv序列是CAR-T研發(fā)中的核心技術(shù)，從華創(chuàng)證券的調(diào)研信息來看，篩選一個合適的scFv序列時間成本和費用成本都不低，鼠源性的成本在幾十萬元，人源化的則需要上百萬元。目前很多科研機構(gòu)使用的序列是從文獻上獲取的，原則上只能用于科研。所以如果是要做創(chuàng)新型CAR-T，進行商業(yè)化，則需要科研機構(gòu)或企業(yè)自主研發(fā)篩選。

      三、CAR-T的轉(zhuǎn)染載體與制備工藝

      為實現(xiàn)CAR在T細胞上的表達，需要通過載體將CAR基因?qū)隩細胞。理想的載體應(yīng)該具有較高的基因轉(zhuǎn)染效率，穩(wěn)定性好，不引起機體免疫反應(yīng)等特點。目前有多種載體用于CAR-T細胞產(chǎn)品制備，包括病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)（如γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體）及非病毒載體轉(zhuǎn)染（如轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染、mRNA電穿孔轉(zhuǎn)染等）等，雖然已開展的臨床試驗中以病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式為主，但以非病毒載體轉(zhuǎn)染的方式也在不斷得到青睞。

      逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種RNA病毒，只能轉(zhuǎn)染分裂期細胞，目的基因可以長期表達，技術(shù)上較為容易，已具有20多年的臨床安全性研究歷史。慢病毒是以HIV病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來的載體，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，轉(zhuǎn)染效率高，插入誘變可能性小，是目前應(yīng)用最多的載體系統(tǒng)。病毒基因轉(zhuǎn)移載體的主要優(yōu)點是制造、生產(chǎn)相對容易以及能夠?qū)⑦z傳物質(zhì)穩(wěn)定整合到宿主基因組中。然而，病毒載體的致病性和潛在的插入誘變可能性在人類臨床試驗中存在顯著的監(jiān)管障礙，非病毒載體的開發(fā)顯得十分重要。轉(zhuǎn)座子和mRNA電穿孔技術(shù)是目前研究比較多的兩類非病毒載體系統(tǒng)。

      相較于病毒載體，轉(zhuǎn)座子能呈遞更大的負荷，成本效益高，免疫原性低。基于轉(zhuǎn)座子的載體系統(tǒng)主要有兩種類型：睡美人（Sleeping Beauty，SB）系統(tǒng)和PiggyBac系統(tǒng)。轉(zhuǎn)座子最終可能發(fā)展成多功能T細胞基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，但目前的DNA電穿孔方法通常產(chǎn)生較差的細胞活力，臨床應(yīng)用中需要擴大T細胞培養(yǎng)以產(chǎn)生大量 T 細胞。

      目前，mRNA電穿孔被認為是最安全的T細胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，其可轉(zhuǎn)導(dǎo)靜止或增殖緩慢的T細胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率多在90%以上，且設(shè)計相對容易，性價比高。臨床上已經(jīng)使用利用瞬時mRNA轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的CAR-T細胞，然而，這種方法需要幾輪CAR-T細胞輸注。在臨床前模型中，mRNA電穿孔轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶向間皮素的CAR-T能引起播散性間皮瘤異種移植物的消退，然而，在灌輸49天后一名患者出現(xiàn)了過敏性反應(yīng)。

      CAR-T細胞的制備需要一些小心操作的步驟，而且整個過程中都需進行質(zhì)量監(jiān)控測試。CAR-T的GMP制備工藝主要包括如下過程：T細胞收集和分離，T細胞激活和修飾，T細胞擴增，T細胞收獲與回輸。生產(chǎn)過程通常需要5-10天，從收集到回輸需要2-4周（根據(jù)病人的臨床狀態(tài)和化療預(yù)處理方案確定）。

      四、展望

      CAR-T細胞制造是一個非常復(fù)雜的過程，制造難、成本高已經(jīng)成為了行業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。目前，吉利德和諾華公司均采用的是集中生產(chǎn)模式，首先在醫(yī)院中提取患者的T細胞，然后將這些細胞運送至制造中心，在制造中心對T細胞進行基因工程設(shè)計，最后將設(shè)計后的T細胞運回醫(yī)院回輸至患者體內(nèi)。然而，無論使用何種制造模式，成功的CAR-T細胞制造都依賴于端到端流程的優(yōu)化能力，包括工作流程的簡化、產(chǎn)能規(guī)劃以及生產(chǎn)的可擴展性等等。傳統(tǒng)的制造工藝以及傳統(tǒng)設(shè)備已經(jīng)不能滿足行業(yè)發(fā)展需求，自動化、全封閉的新一代制造工藝是未來趨勢。隨著CAR-T制造工業(yè)的發(fā)展，目前市場上已經(jīng)有一些解決方案供CAR-T開發(fā)商選擇，例如博雅控股集團旗下的CAR-TXpress？、美天旎的CliniMACS Prodigy？以及GE公司的FlexFactory？等，這些平臺受到了整個行業(yè)的關(guān)注，業(yè)內(nèi)人士也對它們充滿了期待。

      自動化、全封閉的CAR-T制造工藝是規(guī)?；a(chǎn)以及降低制造成本的有效途徑。隨著CAR-T療法獲批上市，市場對新一代制造工藝的需求日益劇增。目前，CAR-T制造創(chuàng)新專利陸續(xù)問世，CAR-T細胞合同定制開發(fā)與生產(chǎn)制造（CDMO）的服務(wù)模式也開始進入國內(nèi)外市場，CAR-T療法迎來了全新發(fā)展階段，有望造福更多患者。