SMN 2基因mRNA前體剪接調節(jié)劑開發(fā)：表型篩選與優(yōu)化實例

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來源：藥渡

2019-03-12

SMA是一種常染色體隱性遺傳的神經肌肉病，常見于嬰幼兒，主要表現(xiàn)為肌肉萎縮、肌張力低、腱反射減弱等，大部分患兒在不到兩周歲時死亡，幸存者也會在成年后喪失大部分運動能力，需要在輪椅上生活。反義核苷酸Nusinersen是目前唯一獲批可用于此病的藥物。

人類的SMN基因有兩種：SMN 1和SMN 2，兩者都位于5號常染色體，且非常相近，其編碼的SMN蛋白若缺失，會導致脊髓中的α神經元死亡，引起脊髓型肌萎縮。SMN蛋白主要由SMN 1基因表達，當其缺失或突變體純合時，SMN 2基因能部分抵消其產生的缺陷，但SMN 2基因中一個堿基異位突變時，造成其轉錄的mRNA前體在剪接時容易丟失7號外顯子，因此只能產生10%-20%的正常SMN蛋白，造成SMA。目前對SMA的治療除上述提及的反義核苷酸Nusinersen外，也有通過基因替換或小分子調節(jié)的方式，但都還處于研究中。脊髓性肌萎縮癥在人群中的攜帶率約為1/35-1/50左右，發(fā)病率約為1/6000-1/10000左右。

Hit compound的發(fā)現(xiàn)

由于SMA是一種典型的信使RNA前體剪接異常造成的關鍵蛋白表達障礙，而mRNA剪接過程較為復雜，涉及到多個因素，因此Novartis采用高通量表型篩選技術，以期能夠得到可調節(jié)SMN 2基因RNA剪接的小分子化合物。

在NSC34運動神經元細胞系中運用Minigene技術作為篩選方法，對大約1.4ⅹ106個化合物進行篩選，不到1%的化合物有響應，以噠嗪為核心骨架的化合物表現(xiàn)出較好的效果，得到代表性化合物1?；衔镌诟咄繙y試條件下，EC50=3.5 μM，相比DMSO的控制組，SMN 2 報告基因信號增強了1700%，在小鼠的SMN ELISA測試中，EC50 = 0.6 μM，SMN蛋白表達水平提高了2.5倍，在人類SMA患者的細胞模型中，SMN蛋白表達水平提高了1.5倍，但是該化合物的血漿清除率較高，口服生物利用度也僅有18%，而且還存在hERG抑制活性，因此需要進一步的藥物化學優(yōu)化。

化合物優(yōu)化

在對化合物進行藥物化學優(yōu)化前，分析其結構可知，1以噠嗪環(huán)為中心結構，左側是一個苯并噻吩的芳環(huán)結構，右側通過一個雜原子（胺）與哌啶環(huán)相連，因此在進行優(yōu)化研究時，可按照上述的分析進行優(yōu)化。

在芳環(huán)體系的優(yōu)化中，將CH衍生為N或者變換N的取代位置，常常會對化合物的活性以及理化性質產生非常明顯的效果！早期的噠嗪環(huán)含兩個鄰位的氮原子，將氮原子變換位置和刪減，并未獲得較為理想的結果，此外，將六元環(huán)調整為五元噻唑環(huán)，活性表現(xiàn)降低。在噠嗪環(huán)上進行甲基取代優(yōu)化中，發(fā)現(xiàn)4位取代的活性要高于5位取代，但是活性還是低于無取代。

噠嗪核的優(yōu)化結果顯示，保留其起始結構是選擇，在對右側四甲基哌啶的結構進行優(yōu)化時，降低哌啶環(huán)的親脂性將會引起活性的下降，而將堿性的哌啶環(huán)用醚環(huán)取代，如呋喃，發(fā)現(xiàn)活性完全喪失，不過這兩種修飾方式都能降低hERG結合活性，由上述結果可知右側四甲基哌啶環(huán)的堿性和親脂性是化合物是提高SMN蛋白水平的重要因素，而連接哌啶環(huán)和噠嗪核的linker，用醚鍵替代效果類似。

左側的苯并噻吩環(huán)在優(yōu)化時，發(fā)現(xiàn)耐受性較好，能夠容忍多種芳環(huán)、芳雜環(huán)的取代，因此該位置不僅可以用于優(yōu)化化合物的活性，還可以調整化合物的理化性質和ADME特征。初步優(yōu)化時，將苯并噻吩替換為噻吩，發(fā)現(xiàn)化合物活性喪失，而用苯并噻吩的電子等排體2-萘（6）取代時，活性保持，而1-萘基（5）則活性下降，主要是因為不能與噠嗪核保持一定的共平面性。當芳環(huán)鄰位有取代時，大部分化合物活性喪失，但是當芳環(huán)鄰位有羥基取代時，活性得到增強，但是也會造成較強的hERG抑制活性，將羥基用甲基封閉后，活性降低了近50倍！

分析上述結果，左側芳環(huán)與噠嗪核的共平面性是決定活性的關鍵因素！對化合物4和其甲氧基取代化合物4-OMe的單晶結構分析，發(fā)現(xiàn)前者萘環(huán)平面與噠嗪環(huán)平面的二面角遠小于后者，主要是因為羥基和噠嗪環(huán)中的氮原子形成氫鍵作用，而當羥基被替換為甲氧基后，氧的孤對電子與噠嗪環(huán)上的氮原子孤對電子的排斥作用，導致二面角增大，表現(xiàn)為活性降低或者喪失！

經過初步的結構優(yōu)化后，將得到的幾個體外活性較好的化合物，如化合物2、3和4進行體內實驗，以確認優(yōu)化成果，具體數(shù)據(jù)如表格所示?；衔?與1相比，只是將linker加了一個甲基，雖然對清除率影響不大，但是提高了化合物的血腦屏障透過率，主要是因為其減少氫鍵供體的數(shù)量，除此之外，化合物2的AUC以及生物利用度得到了明顯的提高，基于上述發(fā)現(xiàn)，保留linker的甲基化是合理的！對比上述三個化合物，選擇化合物3進行進一步的體內活性效果研究。

以SMN delta7的小鼠為模型，不同劑量下SMN蛋白的表達水平呈劑量依賴關系。采用三種不同劑量的化合物喂服模型小鼠，其存活時間明顯提高，但30 mg劑量下的總體表現(xiàn)低于10 mg劑量下的總體表現(xiàn)，表明化合物3存在一定的耐受性問題，例如其較高的hERG結合活性。

將3中的氰基用不同芳雜環(huán)取代，發(fā)現(xiàn)其修飾的耐受性較好，用吡唑替換后（7），活性略有提高，但是顯著降低了脫靶**，將linker用氧原子替代后，雖然活性未發(fā)生多大變化，但在SMN ELISA測試中，SMN蛋白表達水平略有提高，但是都未能改善hERG。

在前期對右側哌啶環(huán)的優(yōu)化中，發(fā)現(xiàn)活性與其堿性和親脂性密切呈正相關，然而在生理pH條件下，與疏水中心鄰近的質子化胺結構是造成hERG結合活性的重要因素，因此，降低親脂性以及pKa就成為了首選優(yōu)化策略！以化合物7為模板，對右側的哌啶環(huán)進行修飾，均未能得到較好的結果，在改善hERG的情況下，活性也會損失！對左側芳環(huán)引入一些極性基團，如將萘環(huán)替換為喹啉或異喹啉、吡唑連接位置調整、在吡唑上引入氨基、羥基等基團等，在活性保持的同時，也降低了hERG結合性，但由于部分化合物PSA的增大，導致透過性降低，如8和12，由于氨基的引入，10的生物利用度僅有4%?；衔?和12的PK數(shù)據(jù)較為平衡，但是在SMN ELISA測試中，SMN蛋白表達水平只提高了2.6倍，而SMN表達效果的為12，有3.1倍之多。

將化合物12的linker采用氧、亞甲基等替換，亞甲基（13）活性降低，但hERG結合性大有改善，氧取代和氮甲基取代，hERG性質類似，但氧取代的SMN蛋白表達水平（3.6倍），此外，氮甲基取代時（12）膜穿透性較差，因此優(yōu)選氧取代化合物進入到臨床階段的，目前正在I/II期臨床研究，預計2020年完成！

總結

mRNA前體的剪接是真核生物中基因表達的關鍵步驟。異常剪接會引起蛋白質的結構和功能改變，是疾病發(fā)生的一個常見原因。據(jù)文獻報道，大約1/3的致病變異會引mRNA的異常剪接，基于Minigene技術的表型篩選方法，為攻克此類疾病的治療提供了重要的方法，通過表型篩選得到理想的化合物后，再利用相關技術確認作用靶點，此類策略是開發(fā)First in class藥物非常有效的方法。在化合物的優(yōu)化過程中，優(yōu)化化合物構型、調整親脂性以及堿性，不僅會影響到化合物的ADME，而且是改善hERG性質的重要方式。

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