在癌癥免疫療法領(lǐng)域，免疫檢查點(diǎn)抑制劑和CAR-T療法無疑是改變癌癥治療模式的兩大突破。然而，免疫檢查點(diǎn)抑制劑已經(jīng)可以用于治療多種癌癥類型，而CAR-T療法的適應(yīng)癥卻屈指可數(shù)。CAR-T療法雖然在治療B細(xì)胞血液癌癥方面表現(xiàn)出卓越的療效，然而治療其它類型癌癥的CAR-T療法還遲遲未能誕生。

       究其根源，CAR-T療法的設(shè)計(jì)和開發(fā)需要克服三大挑戰(zhàn)：缺少理想的腫瘤抗原作為靶點(diǎn)，腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制，和CAR-T療法的嚴(yán)重毒副作用。那么，用什么方法可以克服這三大挑戰(zhàn)，提高CAR-T療法的效果并拓寬其應(yīng)用范圍呢？

       日前，麻省理工學(xué)院（MIT）著名跨界學(xué)者盧冠達(dá)（Timothy Lu）博士在《Nature Reviews Cancer》上發(fā)表文章，介紹了使用合成生物學(xué)構(gòu)建新一代“智能”CAR-T療法的最新進(jìn)展。80后的盧冠達(dá)博士是MIT電子工程、計(jì)算機(jī)科學(xué)和生物工程系教授，也是Senti Biosciences、Tango Therapeutics和Synlogic等多家生物技術(shù)公司的創(chuàng)始人。今天，藥明康德微信團(tuán)隊(duì)將和讀者一起分享這篇文章中的精彩內(nèi)容。

       使用基因回路讓兩種抗原控制CAR-T細(xì)胞的激活

       CAR-T細(xì)胞療法首先從患者體內(nèi)收集T細(xì)胞，然后通過基因工程在T細(xì)胞表面表達(dá)嵌合抗原受體（CAR）。這是一種融合蛋白，它的細(xì)胞外蛋白域是一個(gè)識別腫瘤表面抗原的單鏈可變區(qū)片段（scFv），而細(xì)胞內(nèi)蛋白域包含了T細(xì)胞受體（TCR）和相關(guān)共刺激受體的細(xì)胞內(nèi)蛋白域。這些CAR-T細(xì)胞然后被輸回患者體內(nèi)，它們可以識別和消滅表達(dá)指定抗原的腫瘤細(xì)胞。

       目前，已有兩種CAR-T療法獲得FDA批準(zhǔn)，它們在治療B細(xì)胞血癌方面療效突出。然而，目前獲批的CAR-T療法都只能識別一種抗原。發(fā)現(xiàn)一個(gè)能夠特異性標(biāo)記腫瘤細(xì)胞的腫瘤表面抗原是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，這也是限制CAR-T療法廣泛應(yīng)用的原因之一。

       例如，靶向CD19的CAR-T細(xì)胞能夠有效治療B細(xì)胞血癌，然而因?yàn)镃D19也表達(dá)在正常B細(xì)胞表面，這類療法也會消滅正常B細(xì)胞，從而導(dǎo)致B細(xì)胞發(fā)育不全。雖然靶向CD19的CAR-T療法的這一副作用通常不會致命，而且可以通過靜脈輸入免疫球蛋白來進(jìn)行治療，然而，在靶向其它抗原時(shí)，患者可能無法耐受CAR-T細(xì)胞對正常細(xì)胞的殺傷。

       合成化學(xué)力圖使用工程學(xué)的理論來改造活細(xì)胞，通過在細(xì)胞中加入基因電路（gene circuits），讓它們能夠感知外來信號并且作出簡單的邏輯決策。比如，在設(shè)計(jì)新一代CAR-T細(xì)胞方面，依靠多種抗原來區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，將可以讓CAR-T更為精確靶向腫瘤，并且更具有適應(yīng)性。

       例如，合成生物學(xué)可以設(shè)計(jì)出一種T細(xì)胞，它必須識別腫瘤表面表達(dá)的兩種抗原才會被激活。這一設(shè)計(jì)可以通過人工合成的Notch受體（synNotch）來實(shí)現(xiàn)。synNotch受體在與腫瘤表面的特定抗原A結(jié)合后，通過釋放轉(zhuǎn)錄因子，能夠激發(fā)CAR-T細(xì)胞表達(dá)靶向第二個(gè)抗原B的CAR。在這種情況下，CAR-T細(xì)胞只有在接觸到抗原A，再接觸到抗原B的時(shí)候才會被激活。

       這一synNotch技術(shù)最初由加州大學(xué)舊金山分校的Wendell Lim博士率領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)開發(fā)，并且在動物實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證。Lim博士共同創(chuàng)建了名為Cell Design Labs的公司來轉(zhuǎn)化這一技術(shù)。在2017年12月，吉利德科學(xué)旗下的Kite Pharmaceuticals公司以可高達(dá)5.67億美元的數(shù)額收購了Cell Design Labs，將這一技術(shù)納入該公司的CAR-T開發(fā)平臺。

       而在位于紐約的紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心（MSKCC），Michel Sadelain博士領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)出了同樣依靠兩種不同抗原的另一類CAR-T療法。這一設(shè)計(jì)利用在正常細(xì)胞表面表達(dá)的抗原，抑制CAR-T細(xì)胞的功能。在這種設(shè)計(jì)中，CAR-T細(xì)胞表面表達(dá)著兩種不同的CAR，一種是激活性CAR，它與腫瘤表面表達(dá)的特定抗原A的結(jié)合能夠激活T細(xì)胞。而另一種是抑制性CAR（iCAR），它將靶向正常細(xì)胞表面表達(dá)的抗原B的抗體與免疫檢查點(diǎn)蛋白CTLA-4或PD-1受體的細(xì)胞內(nèi)域融合在一起。這種iCAR在與抗原結(jié)合后能夠抑制T細(xì)胞的激活。當(dāng)表達(dá)兩種CAR的T細(xì)胞同時(shí)接觸到兩種抗原時(shí)，抑制性CAR會抑制激活性CAR的作用。所以，這種CAR-T細(xì)胞只有在接觸到腫瘤特異性抗原A，但是不接觸到正常細(xì)胞中表達(dá)的自體抗原B時(shí)才會被激活。

       接受CAR-T療法治療的腫瘤會通過降低靶向抗原的表達(dá)來逃避CAR-T細(xì)胞的攻擊。例如，很大一部分接受抗CD19 CAR-T細(xì)胞療法的患者出現(xiàn)癌癥復(fù)發(fā)的原因是腫瘤細(xì)胞丟失了CD19抗原的表達(dá)。因此，設(shè)計(jì)能夠識別在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的多種抗原的CAR-T系統(tǒng)可能讓CAR-T細(xì)胞的功能更為全面，防止因?yàn)榭乖瓉G失導(dǎo)致的癌癥復(fù)發(fā)。

       通過注入兩種靶向不同腫瘤抗原的CAR-T療法，或者在同一T細(xì)胞上表達(dá)兩種不同CAR，可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)識別腫瘤上的兩種抗原。而最新的研究方向是在一個(gè)CAR的細(xì)胞外蛋白域中納入兩個(gè)靶向不同抗原的scFvs，生成一個(gè)雙特異性CAR。例如，靶向CD19和CD20的雙特異性CAR已經(jīng)在動物試驗(yàn)中防止CD19陰性的腫瘤復(fù)發(fā)。而靶向CD19和CD22的雙特異性CAR-T療法也表現(xiàn)出良好的臨床前活性。

       使用藥物精確調(diào)控CAR-T細(xì)胞的活性

       目前，在將CAR-T細(xì)胞輸回患者體內(nèi)后，如何調(diào)控免疫反應(yīng)的強(qiáng)度是一個(gè)難題。例如，與CAR-T療法相關(guān)的嚴(yán)重副作用包括細(xì)胞因子釋放綜合征和神經(jīng)**。這些毒副作用產(chǎn)生的原因是，將CAR-T細(xì)胞輸回患者體內(nèi)后，我們?nèi)狈τ行У氖侄蝸砜刂艭AR-T細(xì)胞的增殖、活性和在體內(nèi)的分布。

       為了更精準(zhǔn)地控制CAR-T細(xì)胞的數(shù)量和活性，研究人員已經(jīng)開發(fā)出能夠促發(fā)CAR-T細(xì)胞“自殺”的安全開關(guān)。以Bellicum Pharmaceuticals公司開發(fā)的CaspaCIDe技術(shù)為例，研究人員在CAR-T細(xì)胞中加入了一個(gè)能夠被名為rimiducid的小分子藥物激活的胱天蛋白酶9（Caspase 9）融合蛋白。激活胱天蛋白酶9能夠?qū)е翪AR-T細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，從而終止過度的CAR-T細(xì)胞活性。這一安全系統(tǒng)已經(jīng)被納入該公司的主打通用型T細(xì)胞產(chǎn)品rivogenlecleucel中。在人體試驗(yàn)中，它能夠在注入藥物30分鐘之內(nèi)就啟動細(xì)胞凋亡。

       而另一種通過藥物來對CAR-T細(xì)胞活性進(jìn)行微調(diào)的設(shè)計(jì)方式是，讓CAR的最初狀態(tài)處于未激活狀態(tài)，只有在抗原和其它調(diào)控藥物存在的情況下才能夠被激活。Bellicum公司的GoCAR-T技術(shù)讓CAR的共刺激受體部分受到rimiducid的調(diào)控，只有在CAR-T細(xì)胞與腫瘤抗原蛋白接觸，并且接受rimiducid治療時(shí)，CAR-T細(xì)胞才能夠被激活。該公司目前將這一技術(shù)用于治療實(shí)體瘤的CAR-T產(chǎn)品BPX-601中，目前它已經(jīng)進(jìn)入臨床期開發(fā)，在1/2期臨床試驗(yàn)中接受檢驗(yàn)。

       而上面提到過的UCSF的Wendell Lim博士的研究團(tuán)隊(duì)采用另外一種設(shè)計(jì)用藥物激活CAR-T細(xì)胞活性。他們將傳統(tǒng)的嵌合抗原受體分為兩個(gè)部分，只有在這兩個(gè)部分被藥物連接起來后，CAR才能夠激活下游信號通路，引起免疫反應(yīng)。

       克服腫瘤免疫抑制微環(huán)境的障礙

       CAR-T療法治療實(shí)體瘤需要克服的一個(gè)重要挑戰(zhàn)是腫瘤微環(huán)境介導(dǎo)的免疫抑制。它可能抑制T細(xì)胞的運(yùn)輸和激活，導(dǎo)致雖然CAR-T細(xì)胞能夠識別腫瘤抗原，但是仍然不能夠有效行使它的免疫功能。解決這一挑戰(zhàn)的策略之一是為CAR-T細(xì)胞武裝上新的“武器”，例如讓它們表達(dá)免疫刺激因子IL-12，IL-15或者CD40L。

       例如，MSKCC的Renier J. Brentjens博士率領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)通過讓CAR-T細(xì)胞持續(xù)表達(dá)IL-12，在動物試驗(yàn)中讓這些“武裝”起來的CAR-T細(xì)胞能夠克服腫瘤微環(huán)境的抑制作用。這一團(tuán)隊(duì)還設(shè)計(jì)出表達(dá)抗PD-1抗體的CAR-T細(xì)胞，消除免疫檢查點(diǎn)蛋白對CAR-T細(xì)胞的抑制。

       然而，讓CAR-T細(xì)胞持續(xù)表達(dá)IL-12等促炎癥細(xì)胞因子可能帶來全身性的毒副作用，因?yàn)樵谌硌h(huán)中流動的CAR-T細(xì)胞可以不斷釋放IL-12。為了對IL-12的釋放進(jìn)行調(diào)控，UCSF的Wendell Lim博士設(shè)計(jì)出了使用synNotch控制的治療系統(tǒng)，通過synNotch來在腫瘤微環(huán)境中特異性釋放IL-12等細(xì)胞因子，或者其它治療性蛋白。這些手段都可以納入CAR-T細(xì)胞的設(shè)計(jì)中，進(jìn)一步增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞克服腫瘤微環(huán)境的能力。

       結(jié)語

       合成生物學(xué)已經(jīng)可以通過為CAR-T療法增添基因回路，擴(kuò)展療法的可控性和適應(yīng)能力。我們?nèi)匀恍枰嗟脑囼?yàn)來證明這些新設(shè)計(jì)在臨床情況下的效果和安全性。盧冠達(dá)博士在綜述中同時(shí)指出，這些基因回路的復(fù)雜性意味著，將它們導(dǎo)入細(xì)胞并且整合入基因組將成為研發(fā)過程的瓶頸。我們需要更精簡的基因回路設(shè)計(jì)和更有效的遞送載體。

       合成生物學(xué)在癌癥治療方面的應(yīng)用仍然處于初級階段，我們期待更多的基礎(chǔ)科學(xué)、轉(zhuǎn)化科學(xué)和臨床研究讓基于基因回路的細(xì)胞療法在臨床醫(yī)藥開發(fā)方面展現(xiàn)它的威力。

       參考資料：

       [1] Wu et al., (2019). Engineering advanced cancer therapies with synthetic biology. Nature Reviews Cancer, https://doi.org/10.1038/s41568-019-0121-0

       [2] A suicide switch for CAR-T? Retrieved April 15, 2019, from https://www.iqvia.com/blogs/2019/01/a-suicide-switch-for-car-t

       [3] Bellicum Pharmaceuticals. Retrieved April 15, 2019, from http://www.bellicum.com/

       [4] Cellectis. Retrieved April 15, 2019, from https://www.cellectis.com

       [5] Controlling CAR-T: How scientists plan to make the engineered T cell therapy safer, and work for more cancers. Retrieved April 15, 2019, from https://cen.acs.org/pharmaceuticals/oncology/Controlling-CAR-T-scientists-plan/96/i19

       [6] Wu et al., (2015). Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science, doi: 10.1126/science.aab4077

       [7] Roybal et al., (2016). Engineering T Cells with Customized Therapeutic Response Programs Using Synthetic Notch Receptors. Cell, https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.09.011

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