在一項(xiàng)新的研究中，來自美國馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員開發(fā)出一種利用CRISPR-Cas9和一種很少使用的DNA修復(fù)途徑編輯和修復(fù)一種特定類型的與微重復(fù)（microduplication）相關(guān)的基因突變。這種可編程基因編輯方法克服了之前在基因校正中所遭遇的低效率。相關(guān)研究結(jié)果于2019年4月3日在線發(fā)表在Nature期刊上，論文標(biāo)題為“Precise therapeutic gene correction by a simple nuclease-induced double-stranded break”。
圖片來自Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0)。
論文共同通訊作者、馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子、細(xì)胞與癌癥生物學(xué)教授Scot A. Wolfe博士說，“這就像擊中重置按鈕（reset button）一樣。我們不需要添加任何校正性的遺傳物質(zhì)，而是細(xì)胞將DNA重新拼接在一起，并移除微重復(fù)。這是基因校正的捷徑，具有潛在的治療吸引力。”
微重復(fù)是染色體發(fā)生變化而使得 DNA上的小片段被拷貝或復(fù)制。在某些基因中，當(dāng)添加的核苷酸數(shù)量不能被3整除時，這些微重復(fù)就能夠?qū)е滤^的“移碼突變”。這改變了基因向蛋白的翻譯，從而導(dǎo)致功能喪失。由微重復(fù)引起的移碼突變導(dǎo)致多達(dá)143種不同的疾病，包括肢帶肌營養(yǎng)不良（limb-girdle muscular dystrophy）、赫曼斯基-普德拉克綜合征（Hermansky-Pudlak syndrome）和家族黑蒙性白癡?。═ay-Sachs）。
Wolfe博士是CRISPR-Cas9和其他基于可編程核酸酶的基因編輯方法的專家。大多數(shù)這些技術(shù)都需要在缺陷基因處產(chǎn)生DNA鏈斷裂并引入校正性的遺傳物質(zhì)。將新序列插入到DNA斷裂中，并通過在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種稱為同源介導(dǎo)修復(fù)（homology-directed repair, HDR）的的先天性DNA修復(fù)機(jī)制進(jìn)行修復(fù)。盡管在治療上有希望，但是這種校正基因的方法是低效的并且具有其他的技術(shù)挑戰(zhàn)。
Wolfe和論文共同通訊作者、馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院威爾斯通肌肉營養(yǎng)不良中心主任、神經(jīng)學(xué)教授Charles P Emerson Jr.博士認(rèn)為可能存在更為直接的方法來校正由微重復(fù)引起的疾病。他們推斷如果微同源介導(dǎo)的末端連接（microhomology-mediated end joining, MMEJ）途徑可以被有效利用，而不是利用同源介導(dǎo)修復(fù)途徑，它將會移除重復(fù)序列并恢復(fù)基因的功能序列。
與其他的細(xì)胞修復(fù)機(jī)制相比，MMEJ途徑的效率更低，也更稀有。MMEJ途徑通常會導(dǎo)致DNA斷裂處的兩側(cè)發(fā)生缺失，而且MMEJ途徑只負(fù)責(zé)一小部分DNA修復(fù)---據(jù)一些估計(jì)，不到10%的DNA修復(fù)。
Emerson博士有一個很有希望的疾病目標(biāo)，用于評估這種編輯方法的可行性---由TCAP基因中的微重復(fù)引起的2G型肢帶肌營養(yǎng)不良（LGMD2G）。Emerson實(shí)驗(yàn)室和Wolfe實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的釀膿鏈球菌Cas9核酸酶（Strestococcus pyogenes Cas9, SpCas9）靶向TCAP基因的微重復(fù)中心附近的DNA斷裂。他們接著利用SpCas9處理了源自LGMD2G患者的多能性干細(xì)胞。正如他們預(yù)測的那樣，MMEJ修復(fù)機(jī)制移除了這種微重復(fù)的一個拷貝---有效地將DNA重新拼接在一起，拼接效率非常高，因而去除了突變的遺傳物質(zhì)并讓這個基因得到恢復(fù)，從而能夠產(chǎn)生正常的TCAP蛋白。
Emerson說，“對TCAP基因微重復(fù)進(jìn)行基因編輯的簡單性和高效性是一個非常激動人心的發(fā)現(xiàn)時刻，這就為當(dāng)前無法治療的LGMD2G開發(fā)一種治療方法提供了一個獨(dú)特的機(jī)會，這已成為我們的近期目標(biāo)。”
有多少種由微重復(fù)引起的疾病可能利用MMEJ核酸酶基因編輯加以治療呢？通過與馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院兒科副教授Christian Mueller博士合作，這些研究人員證實(shí)與赫曼斯基-普德拉克綜合征1型相關(guān)的HPS1基因中的微重復(fù)能夠在患者細(xì)胞中加以校正。馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)學(xué)助理教授Oliver King博士隨后開發(fā)出計(jì)算方法來搜索人類基因組數(shù)據(jù)庫，鑒定出143種與微重復(fù)相關(guān)的疾病可能能夠利用他們的Cas9-MMEJ方法加以治療。
Wolfe說，“從這樣一個平常的開始，我們相信這種基于MMEJ的治療策略的簡單性、可靠性和有效性可能允許為許多當(dāng)前無法治療的疾病開發(fā)出基于核酸酶的基因校正療法。”
參考資料：
Sukanya Iyer et al. Precise therapeutic gene correction by a simple nuclease-induced double-stranded break, Nature (2019). DOI: 10.1038/s41586-019-1076-8.
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