作者：樹葉

       雜志：Cancer Discovery

       領(lǐng)域：癌癥免疫

       亮點(diǎn)：

       1）在小細(xì)胞肺癌中，靶向DNA損傷（如抑制PARP）可顯著增加PD-L1的表達(dá)，通過STING介導(dǎo)的T細(xì)胞激活促進(jìn)抗腫瘤免疫。PARP抑制劑聯(lián)合抗PD-L1療法可顯著增強(qiáng)腫瘤消退。

       2）在BRCA缺陷三陰性乳腺癌（TNBC）模型中，PARP抑制劑的功效依賴于瘤內(nèi)STING通路激活誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞募集。這一發(fā)現(xiàn)為聯(lián)合PARP抑制劑與免疫療法治療TNBC提供了理論基礎(chǔ)。

       當(dāng)前，靶向DNA損傷和修復(fù)已在多種腫瘤領(lǐng)域得以應(yīng)用。其中，PARP抑制劑類抗癌藥在BRCA突變腫瘤中具有顯著的抑制作用，已獲得包括治療卵巢癌等在內(nèi)的多個(gè)一線用藥資格。近期，Cancer Discovery雜志發(fā)表了2篇關(guān)于PARP抑制劑通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗癌作用的重要研究進(jìn)展，STING通路的激活在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

       論文一：在小細(xì)胞肺癌中，靶向DNA損傷可通過STING介導(dǎo)的T細(xì)胞激活促進(jìn)抗腫瘤免疫

       小細(xì)胞肺癌（SCLC）常伴有相對(duì)較高的免疫抑制、低水平的T細(xì)胞浸潤(rùn)和抗原呈遞減少等特征。與此一致，在臨床試驗(yàn)中，PD-1或PD-L1阻斷對(duì)于SCLC患者來說，總體響應(yīng)率較低。最近的研究已經(jīng)證明了靶向DNA損傷應(yīng)答（DNA damage response，DDR）途徑作為SCLC治療策略的潛力，包括靶向聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）和檢查點(diǎn)激酶1（CHK1）的藥物，但科學(xué)家們對(duì)靶向DDR的免疫激活特性知之甚少。

       在該篇論文中，來自MD Anderson癌癥中心和斯坦福大學(xué)的科研人員發(fā)現(xiàn)了靶向抑制CHK1和PARP在調(diào)節(jié)T細(xì)胞方面的作用，確認(rèn)了CHK1或PARP的藥理學(xué)抑制增加了腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞的水平，并在多個(gè)SCLC模型中揭示與抗PD-L1療法的協(xié)同作用。

       研究首先表征了靶向DDR對(duì)SCLC模型中PD-L1表達(dá)的影響。研究人員使用PARP抑制劑奧拉帕利處理一組人SCLC細(xì)胞系72小時(shí)，并通過反相蛋白質(zhì)陣列（RPPA）、免疫印跡和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)。分析結(jié)果表明，靶向DDR顯著增加所有被測(cè)試細(xì)胞系中PD-L1蛋白的總水平，提示使用奧拉帕利治療可顯著增加PD-L1表達(dá)（最多3倍，圖1A）。通過基因敲除手段，研究進(jìn)一步驗(yàn)證PARP抑制確實(shí)增加了PD-L1表達(dá)。在使用CHK1抑制劑（Prexasertib）時(shí)體現(xiàn)了類似的結(jié)果。

       圖片來源：Cancer Discovery

       接著，為了測(cè)試PARP抑制對(duì)免疫微環(huán)境反應(yīng)的影響，科學(xué)家們使用PARP抑制劑（奧拉帕利）和抗PD-L1療法進(jìn)行了單藥和聯(lián)用研究。與之前的報(bào)道一致，奧拉帕利單藥治療對(duì)SCLC沒有顯著的抗腫瘤活性，抗PD-L1療法單藥治療在這些模型中也沒有顯示抗腫瘤作用（圖4A）。然而，在奧拉帕利和抗PD-L1聯(lián)合治療組卻觀察到動(dòng)物腫瘤顯著消退，效果甚至持續(xù)到第80天（圖4A、4B）；奧拉帕利+抗PD-L1治療組的總存活率顯著高于抗PD-L1或奧拉帕利單藥治療組（圖4B）。

       圖片來源：Cancer Discovery

       進(jìn)一步的研究確認(rèn)，靶向DDR后的抗腫瘤免疫應(yīng)答通過SCLC中的STING-TBK1-IRF3途徑介導(dǎo)發(fā)生。在使用奧拉帕利處理多個(gè)SCLC細(xì)胞系（H82、H526、H1048）中觀察到STING途徑激活，其中，靶向PARP以時(shí)間依賴性方式增強(qiáng)pSTING_S366、pTBK1_S172、cGAS和pIRF3_S396的表達(dá)（圖5B）。在處理后21天，從小鼠RPP和自發(fā)性肺RPP模型收集的奧拉帕利治療的腫瘤中也觀察到STING途徑的激活（圖5B）。相反，當(dāng)SCLC細(xì)胞系用不誘導(dǎo)DDR的藥物（如紫杉醇）治療時(shí)，沒有觀察到PD-L1或任何主要STING途徑的表達(dá)發(fā)生。

       IFN調(diào)節(jié)因子3（IRF3）先前已被鑒定為I型干擾素基因的轉(zhuǎn)錄因子，特別是IFNβ。由于靶向DDR導(dǎo)致IRF3的激活，研究人員預(yù)測(cè)，靶向DDR后IRF3水平的增加將增強(qiáng)IFNβ mRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，奧拉帕利處理以時(shí)間依賴性方式引起多個(gè)SCLC細(xì)胞系中IFNβ的mRNA表達(dá)顯著增加（圖5C和5D）。在SCLC RPP-mTmG體內(nèi)腫瘤中觀察奧拉帕利（圖5F）處理后IFNβ表達(dá)的類似增強(qiáng)；相反，用紫杉醇處理不會(huì)引起IFNβ mRNA表達(dá)的任何明顯變化，這進(jìn)一步證明STING介導(dǎo)的I型干擾素的激活是DDR靶向介導(dǎo)的。值得注意的是，通過免疫印跡分析證實(shí)，siRNA介導(dǎo)的IRF3敲低消除了奧拉帕利（圖5H）介導(dǎo)的IFNβ mRNA表達(dá)的上調(diào)。同時(shí)，由于I型干擾素途徑可以調(diào)節(jié)PD-L1表達(dá)，接下來研究分析了IRF3對(duì)PD-L1表達(dá)的作用，證實(shí)IRF3敲除消除了奧拉帕利（圖5J）治療后PD-L1蛋白表達(dá)的增加。

       圖片來源：Cancer Discovery

       接下來，研究人員試圖確定聯(lián)合DDR/PD-L1阻斷的協(xié)同抗腫瘤作用是通過腫瘤細(xì)胞cGAS介導(dǎo)的STING活化程度來實(shí)現(xiàn)的。為實(shí)現(xiàn)此目的，在SCLC RPP/mTmG細(xì)胞中耗竭cGAS或STING，并通過蛋白質(zhì)印跡分析確定了敲低效率，然后將cGAS或STING耗竭的腫瘤細(xì)胞注射到免疫活性小鼠中，并用奧拉帕利單獨(dú)或聯(lián)用抗PD-L1治療。研究人員觀察到，相對(duì)于對(duì)照組，在cGAS或STING敲低的腫瘤中，腫瘤消退程度顯著降低（圖6A和6B）。與對(duì)照組腫瘤相反，所有cGAS和STING敲低腫瘤即使用PARP和PD-L1聯(lián)合阻斷也有進(jìn)展，這證實(shí)了在SCLC模型中，cGAS/STING在DDR介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)中具有重要作用。

       圖片來源：Cancer Discovery

       總結(jié)來說，該研究不但揭示了PARP抑制劑在免疫激活途徑中的作用，而且為PARP抑制劑與PD-L1抗體聯(lián)用提供了理論支持。

       論文二：在BRCA缺陷三陰性乳腺癌模型中，PARP抑制劑的功效依賴于瘤內(nèi)STING通路激活誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞募集

       目前，聯(lián)合PARP抑制劑與免疫療法的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，然而，PARP抑制劑的免疫調(diào)節(jié)作用尚未完全研究清楚。在這篇論文中，來自Dana–Farber癌癥研究中心的科研人員試圖剖析PARP抑制劑誘導(dǎo)BRCA1缺陷三陰性乳腺癌（TNBC）腫瘤微環(huán)境變化背后的機(jī)制。

       研究證明，PARP抑制劑奧拉帕利可在體內(nèi)誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)和活化，且CD8+T細(xì)胞耗竭嚴(yán)重?fù)p害抗腫瘤功效。奧拉帕利誘導(dǎo)的T細(xì)胞募集是通過腫瘤細(xì)胞中cGAS/STING途徑的激活以及樹突狀細(xì)胞的旁分泌激活介導(dǎo)的。與HR-成熟（HR-proficient）TNBC細(xì)胞和體內(nèi)模型相比，該效應(yīng)在HR-缺陷TNBC細(xì)胞和體內(nèi)模型中更顯著。利用CRISPR敲除癌細(xì)胞中的STING阻止了促炎信號(hào)傳導(dǎo)，并且在體內(nèi)足以消除奧拉帕利誘導(dǎo)的T細(xì)胞浸潤(rùn)。

       為了確定奧拉帕利誘導(dǎo)的細(xì)胞**T細(xì)胞募集是否通過cGAS/STING信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)，研究人員檢測(cè)了在KB1P-G3-/+BRCA1同基因配對(duì)細(xì)胞系中STING途徑的激活，并觀察了DNA傳感器cGAS。研究結(jié)果顯示，用奧拉帕利處理顯著增加KB1P-G3-BRCA細(xì)胞中cGAS結(jié)合的微核的形成，但未在KB1P-G3+BRCA1細(xì)胞中觀察到這一變化。接下來，研究人員評(píng)估了STING途徑效應(yīng)TANK結(jié)合激酶1（TBK1）的激活，發(fā)現(xiàn)奧拉帕利可誘導(dǎo)KB1P-G3-BRCA細(xì)胞中的TBK1磷酸化，導(dǎo)致TBK1的激活。研究還測(cè)量了IRF3的表達(dá)，其通過Ser396上的磷酸化在TBK1下游激活，與用奧拉帕利處理的KB1P-G3+BRCA1細(xì)胞相比，BRCA1缺陷細(xì)胞的pIRF3熒光強(qiáng)度顯著更高。為了評(píng)估奧拉帕利誘導(dǎo)的cGAS/STING活化是否導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，研究人員測(cè)量了已知主要由STING依賴性信號(hào)傳導(dǎo)的IFNβ的表達(dá)。結(jié)果表明，奧拉帕利顯著上調(diào)KB1P-G3-BRCA細(xì)胞中IFNβ的mRNA水平，但不顯著上調(diào)KB1P-G3+BRCA1細(xì)胞中IFNβ mRNA的水平。之后，研究人員進(jìn)一步檢測(cè)了促炎趨化因子CCL5和CXCL10的表達(dá)，這些趨化因子與TNBC中STING/TBK1/IRF3依賴性信號(hào)傳導(dǎo)和T細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。與IFNβ類似，奧拉帕利處理的KB1P-G3-BRCA細(xì)胞中CCL5和CXCL10的mRNA水平顯著更高。

       進(jìn)一步的體外研究證實(shí)，PARP抑制劑通過STING/TBK1/IRF3途徑誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。為了確認(rèn)這一研究結(jié)果，以及為確定觀察到的TBK1/IRF3信號(hào)傳導(dǎo)的激活是否由PARP抑制劑的直接作用所致，研究人員從骨髓中分化樹突狀細(xì)胞（DC）并在奧拉帕利存在下進(jìn)行培養(yǎng)。雖然STING激動(dòng)劑DMXAA在DC中有效誘導(dǎo)TBK1磷酸化，導(dǎo)致其活化（CD40 +）和成熟（MHCII +），但奧拉帕利不影響這些標(biāo)志物的表達(dá)。這些結(jié)果表明，PARP抑制劑在體內(nèi)先有效激活了BRCA1缺陷型腫瘤細(xì)胞中的cGAS/STING途徑，導(dǎo)致隨后激活DC中的TBK1/IRF3信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而刺激抗原呈遞并因此刺激CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)和活化。

       為了確認(rèn)奧拉帕利在HR缺陷型人TNBC中能否更有效地激活STING途徑，研究人員利用BRCA1缺陷型MDA-MB-436細(xì)胞及其同基因BRCA1重構(gòu)和長(zhǎng)時(shí)間暴露PARP抑制劑后獲得奧拉帕利抗性的MDA-MB-436細(xì)胞來展開相關(guān)研究。分析結(jié)果顯示，奧拉帕利顯著增加了BRCA1缺陷型MDA-MB-436對(duì)照細(xì)胞中cGAS結(jié)合的微核的數(shù)量，但在BRCA1重構(gòu)或PARP抑制劑抗性細(xì)胞中未檢測(cè)到該變化；與cGAS活化一致，在BRCA1缺陷型MDA-MB-436對(duì)照細(xì)胞中奧拉帕利治療顯著誘導(dǎo)cGAMP合成。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與親本和對(duì)照細(xì)胞相比，PARP抑制劑抗性和BRCA1重構(gòu)的MDAMB-436細(xì)胞中響應(yīng)于奧拉帕利的TBK1磷酸化受損；與之一致的是，奧拉帕利在HR缺陷型MDA-MB-436細(xì)胞中有效誘導(dǎo)TBK1磷酸化，但在BRCA1野生型（wt）HR-成熟MDA-MB-231細(xì)胞中沒有誘導(dǎo)TBK1磷酸化。另外，通過測(cè)量pIRF3熒光強(qiáng)度，在用奧拉帕利治療后，在存在BRCA表達(dá)的情況下，免疫顯微鏡檢測(cè)熒光表達(dá)顯著降低。通過流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光顯微鏡測(cè)量，TBK1/IRF3活化與DNA損傷的誘導(dǎo)相關(guān)。更重要的是，cGAS/STING途徑激活不是奧拉帕利特異性的，PARP抑制劑維利帕尼和他拉唑帕尼也能誘導(dǎo)cGAMP合成、TBK1磷酸化和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并且在BRCA缺陷細(xì)胞中比BRCA正常細(xì)胞中更有效?？偨Y(jié)來說，這些數(shù)據(jù)表明，與HR成熟的人類TNBC細(xì)胞相比，在HR缺陷細(xì)胞中，PARP抑制劑可激活STING/TBK1/ IRF3途徑，并隨后更有效地產(chǎn)生I型IFN。

       科學(xué)家們認(rèn)為，該研究闡明了PARP抑制劑在激活STING通路中的額外作用機(jī)制，表明，通過激活癌細(xì)胞STING途徑誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞募集可作為PARP抑制劑治療TNBC療效的關(guān)鍵決定因素。這些發(fā)現(xiàn)為聯(lián)合PARP抑制劑與免疫療法治療TNBC提供了理論基礎(chǔ)。

       相關(guān)論文：

       [1]Triparna Sen et al. Targeting DNA damage response promotes anti-tumor immunity through STING-mediated T-cell activation in small cell lung cancer.Cancer Discovery（2019）.

       [2]Constantia Pantelidou et al. PARP inhibitor efficacy depends on CD8+ T cell recruitment via intratumoral STING pathway activation in BRCA-deficient models of triple-negative breast cancer. Cancer Discovery（2019）.

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