眾所周知，藥物進入機體后，能夠在各種酶的催化下發(fā)生代謝轉變，生成結構相近的代謝產物。雖然結構與母藥類似，但是代謝產物絕對算是項目研發(fā)中出現(xiàn)的新化學成分。利用動物和體外手段對候選化合物進行毒理研究，通常更關注母藥特性，而非代謝產物。并且動物種屬與人體可能存在差異，不能簡單假設所產生的代謝產物就與人體就相同，當某種代謝產物在人體中的暴露量與動物種屬不成比例(disproportional)時，就存在安全性風險。鑒于此，代謝產物安全性評價(MIST，Metabolites in Safety Testing)的概念被提出。

       自上世紀90年代初，液質聯(lián)用技術(LC-MS)取得了突破性發(fā)展，革新了藥物代謝領域的技術手段，在諸如血漿等復雜基質中代謝產物的鑒定也變得相對容易。再加上**標記的ADME(吸收、分布、代謝和排泄)研究能夠對血漿、尿液和糞便生成定量代謝產物譜圖，使得代謝產物研究成為藥物研發(fā)的重要組成部分。

       雖然一般藥物對開發(fā)團隊來說都很清楚代謝產物可能有藥效活性或者**作用，需要予以考察，但是具體到項目，卻面臨以下問題：

       1.哪些代謝產物需要納入安全評價范圍？

       2.是否存在代謝物暴露量的閾值，來決定進一步研究的必要性？

       3.代謝產物的化學結構是否有必要獲得？

       這些都需要有相關可遵循的法規(guī)或指導原則。

       MIST指導原則的變遷

       2002年，飽受人體代謝產物安全性困擾的工業(yè)界率先“發(fā)難”，一群來自不同公司和組織的科學家共同發(fā)表了藥物代謝產物風險評估的建議書(參考文章2)，文章提出在人體血漿中暴露量占比超過藥物相關物質總量25%的代謝產物，必須在臨床前毒理種屬研究中得到覆蓋，這是首次關于MIST的闡述。

       2008年，F(xiàn)DA終于發(fā)布了MIST的指導原則，將代謝物的閾值調整為人體血漿中藥物原型的10%。

       2010年在綜合了更廣泛的意見后，ICH發(fā)布了指導意見，提出在人體血漿中暴露量占比超過藥物相關物質總量10%的代謝產物，在開展大規(guī)模臨床試驗前，有必要對其進行非臨床安全性研究(ICH M3(R2)。FDA隨后跟進，在2016年修改指導原則與ICH看齊。

       圖片整理自參考文章

       這些指導原則在藥物安全性研究方面的促進作用毋庸置疑，但更重要的是它們提供了一個框架，讓藥物研發(fā)對代謝產物的研究有據可依。從臨床前到臨床，每個階段所要解決的藥物代謝問題不盡相同，可能因策略及靶點而不同。如腫瘤晚期、耐藥HIV(艾滋病病毒)、先天性酶缺乏癥等嚴重疾病的藥物開發(fā)，對代謝產物安全性研究有相應簡化措施。對常規(guī)項目，代謝產物典型策略可以分為三個階段來描述：

       第一階段 (Pre-IND)

       在此階段，藥物代謝研究主要針對體外(in vitro)和實驗動物(in vivo)，如肝微粒體、肝細胞、肝S9，重組酶或者血漿等。利用這些體外模型來孵育代謝產物，結合保留時間和質譜裂解規(guī)律來比較不同種屬和人類的代謝產物定性/定量的差異，據此選擇合適的種屬開展毒理研究?；蚴茄芯縿游锝o藥后的體內代謝產物，和體外研究相輔相成。動物的體內結果并不能直接轉化為對臨床的準確預測，而是通過分析動物的主要代謝產物，判斷代謝物譜是否能夠覆蓋人體結果，這對臨床的安全性研究至關重要。

       第二階段 (臨床I期)

       臨床I期多劑量遞增試驗(MAD)的穩(wěn)態(tài)血漿樣本可以用于人體代謝產物研究，這通常也是首次得到藥物的人體代謝產物數(shù)據。LC-MS靈敏度雖然可以滿足微量代謝產物的分析，但是合成代謝產物標準品工作量過大，可以根據紫外吸收數(shù)據計算代謝產物與母藥的相對豐度。

       對于指導原則中代謝產物超過藥物相關物質總量的10%，如何判斷？如果將母藥和所有代謝產物進行定量加和，需要大量合成標準品，顯然不現(xiàn)實?？傮w來講在這個階段，還不需要準確定量，只要對比NOAEL(無明顯損害作用劑量)下毒理種屬的代謝產物和臨床藥效劑量下血漿代謝產物的結果，判斷是否存在臨床前未覆蓋的代謝產物即可。常用方法有兩種，一種是用Hamilton Pooling法計算代謝產物的“暴露量倍數(shù)”；另一種是依靠同位素標記試驗，根據嚙齒類同位素標記的物質平衡結果，對比大鼠的同位素標記代謝產物濃度得到因子，進而換算人體代謝產物的濃度。

       確定了臨床前代謝產物的覆蓋情況，就可以決定是否需要合成代謝物，是否需要開展專門的體內和毒理研究。但是很多研究團隊選擇把這部分工作往后放一放，在完成人體同位素ADME研究后再做決定，更有將針對代謝產物的研究放在臨床概念驗證(PoC)之后的，這也算是避免由于PoC失敗做太多“無用功”。

       圖片源自FDA網站

       第三階段 (臨床II期后，臨床III期前)

       因為對主要代謝產物的研究必須在擴大臨床前完成，所以在這個階段所有必要的代謝物研究都應該結束了。包括代謝物定量、利用高分辨質譜確定未知代謝產物、人體同位素標記ADME研究(還可以用于確定哪些代謝物需要DDI評估)以獲得所有代謝物譜圖等。

       對MIST的一些思考

       從2008年FDA發(fā)布MIST指導原則至今已經十余年了，這十年間，對代謝產物和代謝安全性的重視逐漸深入人心，制藥工業(yè)已經適應了MIST指南的要求，大量案例也為研發(fā)團隊的代謝物研究計劃提供了很好的借鑒。但是也遇到了不少的問題，首先，很少有項目真的開展過對代謝物的毒理研究，也很難找到循環(huán)代謝物直接引起安全問題的案例。很多情況下，明明安全問題已經指向代謝物，但最終又拿不出十足的證據。一方面這可能是由于代謝物和母藥的性質很難區(qū)分，另一方面，對于一些活性中間代謝物，常規(guī)分析方法有時檢測不到，造成很大難度。藥物依帕列凈 (Empagliflozin) 給予大鼠后，觀察到明顯的由代謝物介導的**，但未發(fā)現(xiàn)活性代謝物和下游代謝物。

       其次，反應性代謝物或下游產物(如谷胱甘肽或半胱氨酸結合物的代謝物)由于其分子量和親水性高，通常通過膽汁和/或尿液迅速排泄，因此很難根據MIST的要求比較不同種屬間反應性代謝物的暴露量差異。另外，在一些特定項目中測定靶組織中代謝物可能更為重要，卻難以在人體開展。換句話說，隨著技術的發(fā)展，對代謝產物的研究要做到何種程度？MIST所做的一切是否真的影響了藥物安全性評價，這些都是未來我們需要去思考和解決的。

       指導原則只是提供了一個方向，對每個項目一定要case by case的去針對性設計研究方案，除了常規(guī)**，還應關注代謝物潛在的DDI發(fā)生。吉非羅齊 (Gemfibrozil)的葡萄糖醛酸化代謝物對西立伐他汀(cerivastatin)的代謝清除抑制(主要由CYP2C8和OATP1B1介導)導致了嚴重的后果。此外還有丁苯丙酮的代謝物對CYP2D6表達水平的影響，以及去甲基地爾硫卓對CYP3A4的抑制作用等。FDA和EMA的指導原則分別建議，當代謝物的體內水平達到母藥的25%(FDA, 2012)，或暴露量超過藥物總暴露量的10%時(EMA, 2012)，需要對代謝產物的CYP抑制和轉運體抑制開展研究。FDA在2017年新的相關指導原則征求意見稿中進一步要求，對警示性化學結構(官能團)，需要開展TDI(時間依賴性抑制)研究；對極性小于母藥且暴露量超過母藥25%的代謝產物，以及極性大于母藥且暴露量高于母藥的代謝產物，需要開展代謝物體外DDI研究。

       總之，MIST指導原則的提出不僅僅是DMPK科學家的研究參考，很大程度上也讓藥化、藥理等科學家對代謝產物的安全性問題給予足夠的重視，只有這樣，新藥的安全評價才會更加徹底，這也是MIST對藥物研發(fā)的貢獻。

       參考文章：

       [1] A Decade in the MIST: Learnings from Investigations of Drug Metabolites in Drug Development under the “Metabolites in Safety Testing” Regulatory Guidance. DOI: https://doi.org/10.1124/dmd.117.079848

       [2] Drug Metabolites in Safety Testing. DOI:10.1006/taap.2002.9440

       [3] Metabolites in safety testing. https://doi.org/10.4155/bio.09.98

       [4] FDA-Safety Testing of Drug Metabolites Guidance for Industry.

       [5] Guidance for Industry M3(R2) Nonclinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials and Marketing Authorization for Pharmaceuticals.

       [6] Metabolites in Safety Testing: “MIST” for the Clinical Pharmacologist. doi:10.1038/clpt.2009.283

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