時隔3年，曾處于輿論旋渦的韓春雨公開了一項最新研究成果。
近日，韓春雨在預印本網(wǎng)站BioRxiv上發(fā)表了一篇關于基因編輯的新文章：Background free tracking of single RNA in living cells using catalytically inactive CasE。
文章共有5名作者，依次為Feng Gao, Yue Sun, Feng Jiang, Xiaoyue Bai, Chunyu Han，工作單位均為河北科技大學基因編輯研究中心。其中，韓春雨為通訊作者。
論文中提到的CasE是Ⅰ-E型 CRISPR復合物的核心成分，它通過結合特定的莖環(huán)區(qū)域單獨處理pre-crRNA，稱之為 CasE Binding S，簡稱為CBS。CasE保守His20參與催化活性，ΔHis26-TtCse3突變的CasE（dCasE）則失去了催化活性，但仍然與其靶標緊密結合。
在該研究中，通過將 split 熒光與dCasE的N端和C-末端（ΔHis20）融合，構建了活體RNA跟蹤工具VN-dCasE-VC。該系統(tǒng)僅在存在靶RNA時才發(fā)出熒光，從而增強信噪比。
在活細胞中進行可視化的RNA追蹤，不需要特定的亞細胞分布。CasE-GFP和dCasE-GFP在HEK293T細胞中的高水平表達和均勻分布表明CasE和dCasE適合于活細胞中的RNA操作。
為了測試CasE在哺乳動物細胞中表達時是否具有強活性，作者構建了“關閉”報告基因質粒CBS-GFP-N1。它由5′-UTR中的GFP mRNA和CasE結合位點（CBS）組成。當CasE被引入系統(tǒng)時，GFP表達水平急劇下降。
同時，為了進一步測試CasE活性，作者還構建了“開啟”報告基因質粒RED-16×CBS-Lin28-C1，其中CBS插入RED單體基因的3′-UTR區(qū)和Lin28的上游。Lin28是RNA核保留信號，在其3′-UTR中具有l(wèi)in28信號的RED單體mRNA幾乎不能翻譯成蛋白質。
CBS-CasE依賴限制性切斷l(xiāng)in28信號并從核釋放靶mRNA用于翻譯（圖1E和圖1F）。這些表明CasE可以結合并切割哺乳動物細胞中的CBS。
另外，為了將dCasE-CBS相互作用設計到RNA追蹤系統(tǒng)中，作者通過將split-FP5-7與dCasE蛋白結合。發(fā)現(xiàn)一個版本，即VN-dCasE-VC很難發(fā)出熒光，這可能是由于不正確的折疊或不穩(wěn)定的狀態(tài)，但是當與靶RNA（CBS）結合時，可以在熒光顯微鏡下清楚地捕獲熒光信號，即使VN-dCasE-VC表達質粒的轉染劑量非常低。
接下來，作者使用VN-dCasE-VC系統(tǒng)追蹤哺乳動物細胞中過表達的β-肌動蛋白（β-Actin）的mRNA，VN-dCasE-VC系統(tǒng)在細胞質中顯示出強熒光。此外還觀察到，向靶mRNA添加更多CBS可改善信號，熒光追蹤更清晰，因此，可以通過增加CBS的數(shù)量來檢測低豐度的mRNA。
總的來說，韓春雨團隊發(fā)明了一種新的RNA追蹤工具，將其命名為VN-dCasE-VC，該系統(tǒng)能夠追蹤活細胞中沒有背景的特定RNA，通過熒光將其可視化。
目前已有兩種活細胞RNA追蹤成像工具，一種是MS2，一種是Cas13a，韓春雨團隊開發(fā)的dCasE系統(tǒng)，成像效果由于MS2，而且，dCasE蛋白的分子量為22kDa，遠小于Cas13a的130kDa，dCasE的小分子量更容易遞送至細胞內(nèi)，因此更適合用于活細胞的RNA追蹤。
一位接近韓春雨的人士透露：“這篇文章是此前韓春雨工作的延續(xù)，目的都是開發(fā)基因編輯工具。”
不過，值得注意的是，該研究目前發(fā)表于預印本網(wǎng)站，尚未經(jīng)過同行評議，
對此，有科研人士指出，首發(fā)在未經(jīng)同行評議的預印本上，是為了獲得首發(fā)權。“韓春雨下一步還會投正式期刊的。”前述人士推測。
不知道此次新的研究成果是否會再次給韓春雨帶來關注，2016年5月，《自然—生物技術》發(fā)表韓春雨團隊新的基因編輯技術NgAgo，被媒體以“甘坐冷板凳、十年憋大招”的故事原型炒作而走紅，此后半年，韓春雨個人及其所在大學陸續(xù)獲得各類名譽和大量經(jīng)費資助，但亦有國內(nèi)多名基因編輯領域科學家實名發(fā)聲稱實驗結果難以重復，懷疑實驗結果的真實性。
2017年8月，《自然—生物技術》發(fā)表題為《是該數(shù)據(jù)說話的時候了》社論，宣布撤回韓春雨團隊于2016年5月2日發(fā)表在該期刊的論文。
2018年9月，河北科技大學發(fā)布公告，韓春雨團隊不存在主觀造假。但依據(jù)有關規(guī)定，取消韓春雨所獲得的榮譽稱號，終止韓春雨團隊承擔的科研項目并收回科研經(jīng)費。
韓春雨團隊回應稱，實驗設計存在缺陷、研究過程存在著不嚴謹?shù)膯栴}。
有業(yè)界人士表示：“這波之后，NgAgo這個研究方向在中國做得很慢。韓春雨他們的工作開展起來也比較困難，連學生也沒有新招。”
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