“活下來，就仍然擁有希望！”這是一名杜興氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）患者說過的話。

       DMD是由于在X染色體上編碼抗肌萎縮蛋白的基因上出現(xiàn)突變而導致的罕見遺傳病?？辜∥s蛋白的缺失或缺陷，導致肌肉在收縮過程中出現(xiàn)慢性損傷，炎癥發(fā)作，影響肌肉的再生。最終，肌肉被瘢痕組織或者脂肪代替。患者的肌無力癥狀在2-3歲時就很明顯，隨著肌肉組織和功能的不斷丟失，在12歲時通常只能靠輪椅行動，20歲時需要輔助呼吸，在30-40歲時因為呼吸或心力衰竭而早夭。

       目前，大部分現(xiàn)有療法只能緩解疾病癥狀，卻不能針對疾病根源，DMD患者的希望在于創(chuàng)新療法的開發(fā)。而今天的新聞卻不是那么令人喜悅——開發(fā)DMD創(chuàng)新療法的Sarepta Therapeutics公司宣布收到了FDA對其DMD療法golodirsen的完整回復信（CRL）。由于對與靜脈輸液接口（intravenous infusion ports）相關的感染和golodirsen在臨床前動物模型中表現(xiàn)出的腎 臟**的疑慮，F(xiàn)DA沒有加速批準golodirsen上市。

       除了golodirsen以外，多家公司和研究機構也在針對DMD發(fā)病的根本原因——抗肌萎縮蛋白的缺失，開發(fā)創(chuàng)新療法。下面，我們來看一看這些療法的最新進展。

       ▲治療DMD的外顯子跳躍和基因組編輯療法（圖片來源：參考資料[4]）

       外顯子跳躍療法

       外顯子跳躍療法通過使用RNA或者DNA片段，讓表達抗肌萎縮蛋白的RNA前體在剪接時跳過特定外顯子。因為DMD患者的基因突變會造成閱讀框（reading frame）移動，從而生成沒有功能的抗肌萎縮蛋白。而外顯子跳躍療法去除了基因突變帶來的閱讀框移動，生成的抗肌萎縮蛋白雖然比正常蛋白短一些，但是仍然具有抗肌萎縮蛋白的部分功能。Sarepta公司的golodirsen就是一款外顯子跳躍療法，該公司開發(fā)的eteplirsen已經(jīng)獲得FDA批準上市。

       除了Sarepta以外，Wave Life Sciences，第一三共（Daiichi Sankyo），和NS Pharma都在開發(fā)不同的外顯子跳躍療法。其中Sarepta公司的casimersen和NS Pharma公司的viltolarsen有望今年遞交監(jiān)管申請。

       外顯子跳躍療法的局限性在于它是針對抗肌萎縮蛋白基因上特定基因突變而開發(fā)的療法。因此，只有在這些區(qū)域出現(xiàn)基因突變的DMD患者才適合使用這些療法。而且，目前外顯子跳躍療法生成的抗肌萎縮蛋白水平并不是很高，以golodirsen為例，雖然接受治療的DMD患者抗肌萎縮蛋白表的水平是基線的16倍，但是也只達到正常水平的1%左右。提高外顯子跳躍療法生成的抗肌萎縮蛋白水平是提高這一療法療效的關鍵。

       因為DMD患者全身的肌肉組織都需要接受治療，因此外顯子跳躍療法需要通過全身性給藥的方式對患者進行治療。目前這一領域的研發(fā)重心之一是如何提高輸入到患者體內的RNA/DNA片段靶向遞送到肌肉的能力。以Sarepta公司的SRP-5051為例，這款外顯子跳躍療法在已經(jīng)獲批的eteplirsen上面偶聯(lián)了靶向肌肉組織的多肽，從而提高了eteplirsen向肌肉組織遞送的能力。

       基因療法

       另一類提高抗肌萎縮蛋白水平的療法是基因療法。這種方法將表達抗肌萎縮蛋白的轉基因包裝在AAV病毒載體中，然后將這些病毒注入患者體內。它們通過轉染患者的肌肉細胞，讓肌肉生成具有部分抗肌萎縮蛋白功能的重組蛋白?；虔煼ǖ膬?yōu)勢在于，它可以對攜帶任何類型DMD基因突變的患者生效。以AAV病毒作為載體的基因療法高效轉染肌肉組織的能力已經(jīng)得到了證實。而且，基因療法理論上可以讓患者接受一次治療之后，獲得長期持久的改善，而上面提到的外顯子跳躍療法需要患者長期不斷接受治療。

       然而，DMD基因是人類基因組中的基因之一，而遞送基因療法的AAV病毒載體能夠容納的基因長度有限，因此，目前包裝進入AAV載體的DMD轉基因通常編碼的是稱為“微抗肌萎縮蛋白”的精簡版抗肌萎縮蛋白。這種重組蛋白保留了抗肌萎縮蛋白最關鍵的N端和C端蛋白結合域，但是刪除了蛋白中間的大量血影蛋白樣重復（spectrin-like repeats）。微抗肌萎縮蛋白只能彌補全長抗肌萎縮蛋白的部分功能。

       ▲全長抗肌萎縮蛋白（a）和基因療法表達的幾種微抗肌萎縮蛋白（b）（圖片來源：參考資料[4]）

       基于AAV載體的基因療法需要面對的另一個挑戰(zhàn)是很多患者體內已經(jīng)存在對AAV病毒載體的免疫力。這會導致基因療法還未能生效，就被患者自身的免疫系統(tǒng)清除。而且，在接受基因療法后患者體內也會產生免疫反應，這意味著如果基因療法在幾年后失效，他們無法再度接受同一療法的治療。這是所有基于AAV載體的基因療法需要解決的挑戰(zhàn)。

       目前，Sarepta公司的研發(fā)管線中也有一款名為SRP-9001的基因療法。這一療法使用的是從非人靈長類動物中分離出的AAVrh74載體，它的優(yōu)點是能夠在肌肉中引起轉基因的強力表達，不會穿過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。而且，較少患者體內存在針對這一病毒載體的免疫力。SRP-9001基因療法由MHCK7啟動子驅動轉基因的表達。這款啟動子不但能夠在骨骼肌、心肌和膈肌中驅動轉基因表達，而且尤其增強了轉基因在心臟中的表達。

       除了Sarepta公司以外，輝瑞（Pfizer）公司最近公布了基于AAV9病毒載體的DMD基因療法的1b期臨床試驗結果，并且計劃在2020年開展3期臨床試驗。而Solid Biosciences公司的DMD基因療法SGT-001最近也獲得FDA放行，繼續(xù)進行臨床試驗。

       基因組編輯療法

       多家學術研究機構已經(jīng)使用基于CRISPR的基因編輯技術，開發(fā)治療DMD的基因編輯療法。這類療法目前還處于臨床前實驗階段。它與外顯子跳躍療法有些類似，利用CRISPR基因編輯技術在患者DMD基因上切除包含基因突變的特定外顯子，從而消除基因突變對抗肌萎縮蛋白生成的影響。與外顯子跳躍療法相比，它的優(yōu)勢在于永久性改變了患者DMD基因的結構，因此理論上只需要一次治療，就可以讓患者終身受益。今年杜克大學（Duke）研究團隊在Nature Medicine雜志上發(fā)表的研究表明，在小鼠模型中，治療DMD的基因編輯療法在一年之后仍然可以維持表達抗肌萎縮蛋白的效果。

       基因組編輯療法同樣需要使用AAV病毒載體遞送，因此同樣需要克服對AAV病毒載體的免疫力的挑戰(zhàn)。而基因組編輯療法面對的獨特挑戰(zhàn)在于CRISPR基因編輯系統(tǒng)的“脫靶效應”。由于DMD患者需要接受全身性療法，避免CRISPR基因編輯系統(tǒng)的“脫靶效應”變得非常關鍵。

       通讀終止密碼子（Stop Codon Readthrough）療法

       在大約13%的DMD患者中，基因突變導致終止密碼子的出現(xiàn)，這種基因突變不會造成閱讀框的改變，而是導致蛋白合成過早終止，生成沒有功能的抗肌萎縮蛋白。

       有些化合物通過與終止密碼子相結合，可以讓負責轉譯RNA的核糖體在讀到終止密碼子的地方添加一個氨基酸，而不是停止轉譯過程。通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)的ataluren在動物實驗中能夠提高抗肌萎縮蛋白表達水平，并且具有相對良好的安全性和耐受性。這款藥物已經(jīng)在2014年獲得歐盟有條件批準，商品名為Translarna。然而，在隨后進行的驗證性3期臨床試驗中，ataluren沒有達到試驗的主要終點。目前，ataluren在新的驗證性3期臨床試驗中接受檢驗。

       通讀終止密碼子療法的局限性在于，它只能治療產生終止密碼子的DMD基因突變。

       結語

       在收到FDA的CRL之后，Sarepta公司總裁兼首席執(zhí)行官Doug Ingram先生表示，將盡快與FDA會晤，全面解決CRL中提出的疑慮，并且尋找盡快批準golodirsen上市的監(jiān)管通路，因為：

       “患者們等不及了！”

       誠然，開發(fā)有效DMD療法的道路上挑戰(zhàn)眾多，挫折在所難免，我們期待研發(fā)人員能夠砥礪前行，早日將患者們期盼的希望交到他們手中。

       參考資料：

       [1] Sarepta Therapeutics Receives Complete Response Letter from the US Food and Drug Administration for Golodirsen New Drug Application. Retrieved August 19, 2019, from https://investorrelations.sarepta.com/news-releases/news-release-details/sarepta-therapeutics-receives-complete-response-letter-us-food

       [2] Sarepta Announces FDA Acceptance of Golodirsen (SRP-4053) New Drug Application for Patients with Duchenne Muscular Dystrophy Amenable to Skipping Exon 53. Retrieved August 15, 2019, from https://investorrelations.sarepta.com/news-releases/news-release-details/sarepta-announces-fda-acceptance-golodirsen-srp-4053-new-drug

       [3] SAREPTA 2019 PPMD ANNUAL CONFERENCE PRESENTATION (RNA therapy). Retrieved August 19, 2019, from https://investorrelations.sarepta.com/static-files/33df8d49-8c3d-4a88-8717-12723b4a0750

       [4] Verhaart and Artsma-Rus. (2019). Therapeutic developments for Duchenne muscular dystrophy. Nature Reviews Neurology, https://doi.org/10.1038/s41582-019-0203-3

       [5] SAREPTA 2019 PPMD ANNUAL CONFERENCE PRESENTATION (gene therapy). Retrieved August 19, 2019, from https://investorrelations.sarepta.com/static-files/99d3a9d7-df9a-45dc-922a-4e6a7c6f0e41

       [6] Nelson et al., (2019). Long-term evaluation of AAV-CRISPR genome editing for Duchenne muscular dystrophy. Nature Medicine, https://doi.org/10.1038/s41591-019-0344-3.

       [6] SAREPTA 2019 PPMD ANNUAL CONFERENCE PRESENTATION (gene therapy). Retrieved August 19, 2019, from https://investorrelations.sarepta.com/static-files/99d3a9d7-df9a-45dc-922a-4e6a7c6f0e41