一、研究背景

       1. 質(zhì)量即生命

       由于生物制品通常是直接注射給藥，產(chǎn)品若遭受病毒污染，對(duì)患者可能造成重大傷害。在人類歷史上，**和血液制品等都曾出現(xiàn)過(guò)病毒污染的案例。

       表1 歷史上生物制品病毒污染案例

       現(xiàn)代生物制品經(jīng)常使用動(dòng)物細(xì)胞來(lái)作為蛋白表達(dá)生產(chǎn)系統(tǒng)，以保證產(chǎn)物的正確構(gòu)象和活性，比較常見的一種就是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系（CHO細(xì)胞）。作為嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞，CHO細(xì)胞常表達(dá)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒，在細(xì)胞上清中通常可檢測(cè)到103～109/mL逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒。這些顆粒形態(tài)、生化性質(zhì)、序列等與傳染性逆轉(zhuǎn)錄病毒相似。

       CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中有可能發(fā)生外源性病毒污染，各國(guó)藥監(jiān)機(jī)構(gòu)要求臨床試驗(yàn)前和生產(chǎn)階段前的申報(bào)材料中，純化工藝必須經(jīng)過(guò)病毒清除/滅活驗(yàn)證，以確保無(wú)論是臨床試驗(yàn)患者注射用，還是推向市場(chǎng)的產(chǎn)品，均不會(huì)出現(xiàn)病毒污染，釀成重大醫(yī)療事故。

       2. 國(guó)內(nèi)外病毒清除驗(yàn)證法律法規(guī)

       美國(guó)、歐盟法規(guī)建立相對(duì)較早，體系相對(duì)健全；國(guó)內(nèi)法規(guī)發(fā)布較晚，主要在參照美國(guó)、歐盟法規(guī)的基礎(chǔ)上，結(jié)合自身實(shí)際，做了一定的完善。

       隨著國(guó)外申報(bào)或中外雙報(bào)的生物制品企業(yè)越來(lái)越多，本文整理了關(guān)于國(guó)內(nèi)外病毒清除驗(yàn)證法律法規(guī)及遵循的指導(dǎo)原則，見表2。

       表2 國(guó)內(nèi)外病毒清除驗(yàn)證法律法規(guī)

       二、病毒清除驗(yàn)證常用指示病毒

       病毒清除/滅活驗(yàn)證中，最好的情況是把每種可能出現(xiàn)的污染病毒都做一次驗(yàn)證，研究數(shù)據(jù)越多、覆蓋面越廣、報(bào)告說(shuō)服力越強(qiáng)，但考慮時(shí)間、人力和資金的成本，每種病毒都做一遍，不太現(xiàn)實(shí)。

       結(jié)合已有的科學(xué)研究，美國(guó)、歐盟等藥監(jiān)機(jī)構(gòu)官員及病毒學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)家提出了指示病毒的概念，即建議在病毒清除驗(yàn)證過(guò)程中采用的病毒包含以下四種特性即可：“單鏈和雙鏈的RNA及DNA、脂包膜和非脂包膜、強(qiáng)和弱抵抗力、大和小顆粒等”。

       具體來(lái)看，在IND階段，主要以逆轉(zhuǎn)錄病毒、細(xì)小病毒和皰疹病毒的清除能力作為抗體或者融合蛋白的病毒清除驗(yàn)證指標(biāo)。在NDA和BLA階段，主要使用3～5種指示病毒，呼腸孤病毒、小核糖核酸病毒、多瘤病毒等其他種類病毒的比例會(huì)有所增加。

       表3 四種常用指示病**質(zhì)

       三、國(guó)內(nèi)外病毒清除驗(yàn)證申報(bào)差異

       1. 指示病毒的差異

       國(guó)內(nèi)指導(dǎo)原則要求比較詳細(xì)具體，明確指出了病毒類型；國(guó)外規(guī)則沒(méi)有寫明病毒具體要求，僅要求盡可能選擇污染產(chǎn)品最相似的病毒進(jìn)行驗(yàn)證，即特異性指示病毒；同時(shí)需要關(guān)注理化性質(zhì)較寬的非特異性病毒。

       2. 工藝選擇上的差異

       國(guó)內(nèi)IND申報(bào)時(shí)，一般選擇低pH和膜過(guò)濾這兩個(gè)工藝進(jìn)行驗(yàn)證；國(guó)外申報(bào)時(shí)，除了選擇低pH和膜過(guò)濾，還需進(jìn)行層析工藝驗(yàn)證。

       3. 在工藝重復(fù)性方面的差異

       國(guó)內(nèi)指導(dǎo)原則雖然沒(méi)有硬性規(guī)定，但通常需要做三個(gè)批次；在國(guó)外的指導(dǎo)原則中，明確指出至少分別做兩次獨(dú)立的研究來(lái)證實(shí)清除的可重復(fù)性，因此一般是一批樣品重復(fù)2次。

       表4 國(guó)內(nèi)外病毒清除驗(yàn)證工藝流程對(duì)比

       四、我國(guó)病毒清除/滅活驗(yàn)證技術(shù)服務(wù)機(jī)構(gòu)

       目前，進(jìn)行病毒清除驗(yàn)證研究有三種方式：企業(yè)自驗(yàn)證、第三方驗(yàn)證、中檢院驗(yàn)證（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。限于建設(shè)生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室的高昂成本，以及在構(gòu)建符合國(guó)內(nèi)外申報(bào)標(biāo)準(zhǔn)的病毒清除/滅活驗(yàn)證體系方面的困難，比如獲得相應(yīng)的指示病毒株，為控制成本考慮，大多數(shù)生物制藥企業(yè)主要提交中檢院或者第三方機(jī)構(gòu)開展病毒清除滅活驗(yàn)證。

       近年來(lái)，單克隆抗體和重組蛋白類等生物制品研發(fā)熱火朝天，在眾多生物制藥企業(yè)的迫切需求之下，第三方技術(shù)服務(wù)機(jī)構(gòu)逐漸增多，并逐步接軌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。目前，國(guó)內(nèi)第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)有蘇州藥明康德檢測(cè)檢驗(yàn)、中科世生、義翹神州、蘇州良辰、武漢珈創(chuàng)、南京鐘鼎等。

       表5 國(guó)內(nèi)病毒清除/滅活驗(yàn)證技術(shù)第三方機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)介

       以年均開展病毒清除業(yè)務(wù)批次為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)進(jìn)行分析，南京鐘鼎和藥明檢測(cè)在第三方服務(wù)市場(chǎng)中各占三分之一，北京義翹神州則排在第三位（占19%）。從地域分布上，第三方驗(yàn)證機(jī)構(gòu)主要分布在北京和長(zhǎng)三角等地區(qū)，華南和西部地區(qū)還是一片空白。

       圖 六家服務(wù)企業(yè)在第三方病毒清除驗(yàn)證市場(chǎng)份額

       五、小結(jié)

       目前生物制品病毒清除/滅活驗(yàn)證機(jī)構(gòu)屈指可數(shù)，有些機(jī)構(gòu)驗(yàn)證使用的方法或采用的指示病毒不同，其報(bào)告并不被國(guó)外評(píng)審機(jī)構(gòu)認(rèn)可，而申報(bào)國(guó)外的話，有時(shí)只能轉(zhuǎn)戰(zhàn)國(guó)外機(jī)構(gòu)。由此可見，我國(guó)病毒清除驗(yàn)證領(lǐng)域還需深耕，亟待借鑒國(guó)際先進(jìn)理念和經(jīng)驗(yàn)，科學(xué)開展研究等提高行業(yè)實(shí)力。

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