前不久，筆者介紹過生物技術藥物5大類別的特點及其市場和代表藥物情況。在細述上述內容的基礎上，本稿件將從技術角度來聊一聊，生物技術藥物的藥學研究都有哪些內容。PS：大多數(shù)生物技術藥的化學本質是蛋白質，其藥學研究有不同于化學藥物的特殊性，下面將以蛋白質藥物為例來進行說明。

       01  穩(wěn)定性~影響蛋白質類藥物的重要屬性之一！

       相對而言，蛋白質類藥物的穩(wěn)定性不如化學藥物，其不穩(wěn)定性可簡單分為兩種：化學不穩(wěn)定和物理不穩(wěn)定。

       化學不穩(wěn)定

       主要指蛋白質分子通過共價鍵的形成和斷裂形成新的化學實體，包括水解、氧化、外消旋、β消旋和二硫鍵的交換。一般肽鍵在生理條件下相當穩(wěn)定，但可被酸、堿或蛋白酶催化水解，使蛋白質分子斷裂，分子量減少。蛋白質中一些氨基酸可以發(fā)生自氧化，在氧化劑存在下，蛋白質中的某些氨基酸側鏈很容易被氧化，使蛋白質失活。含有芳香側鏈的氨基酸如甲硫氨酸、半胱氨酸、組氨酸、色氨酸和酪氨酸的蛋白質易發(fā)生氧化反應（影響氧化的因素有溫度、pH、緩沖介質、催化劑的種類和氧的強度等）。蛋白質在堿水解中常伴有某些氨基酸的消旋化作用，使氨基酸成為非代謝形式，從而改變蛋白質的生物活性（影響氨基酸消旋作用的因素有溫度、pH、離子強度和金屬離子螯合作用）。二硫鍵對穩(wěn)定蛋白質的構象起重要作用，加熱可引起二硫鍵的斷裂或交換，導致蛋白質的生物活性快速喪失。

       物理不穩(wěn)定

       指蛋白質分子的高級結構的物理轉變，無共價鍵改變，包括變性、表面吸附、聚集和沉淀。蛋白質中非共價鍵的破壞可導致蛋白質變性。在某些物理、化學的條件下，蛋白質分子的高級結構受到破壞（但一級結構未被破壞），結果引起蛋白質生物活性的損失和理化性能的改變，這就是蛋白質的變性。影響蛋白質變性的因素有：溫度、pH、鹽類、有機溶劑、表面活性劑、機械應力、超聲波、光照等。

       表面吸附可導致蛋白質構象的變化，使蛋白質分子變性，活性喪失。同時由于蛋白質多肽類藥物有效劑量小，吸附作用使制劑中藥物含量顯著降低，療效降低。使用表面活性劑、加入載體蛋白如血清白蛋白可減少其表面吸附。蛋白質溶液是一種穩(wěn)定親水膠體，但在外界因素（pH、溶劑、離子強度、溶劑介電常數(shù)）的影響下發(fā)生自締合形成二聚體、低聚物等。在外界因素影響下，蛋白質分子結構發(fā)生伸展，疏水區(qū)暴露于水性環(huán)境，形成熱力學不穩(wěn)定體系，驅使暴露的疏水區(qū)分子間相互聚集形成聚集體。蛋白質沉淀通常與變性同時發(fā)生。蛋白質溶液中加入大量的中性鹽、重金屬、有機溶劑或者加熱均可導致蛋白質的沉淀。

       02  蛋白質類藥物相關給藥系統(tǒng)

       現(xiàn)如今，小分子藥物已形成多種給藥方式，但對于大分子生物制劑，通常仍以注射給藥為主，但近年來口服給藥等小分子藥物常用劑型已逐漸成為開發(fā)大分子藥物的亮點。

       蛋白質類藥物給藥途徑

       注射給藥

       蛋白質、多肽類藥物由于口服吸收的限制，臨床多采用注射途徑給藥，包括靜脈注射、肌內注射、皮下注射、腹腔注射。但蛋白質、多肽類藥物一般體內血漿半衰期較短，清除率高，須頻繁注射給藥。

       延長蛋白多肽類藥物體內半衰期最簡單的方法是靜脈注射給藥改為肌內注射或皮下注射。采取此法時應注意隨之引起的蛋白質降解和體內的變化。另一種方法是采取新的給藥系統(tǒng)延緩藥物的釋放，如輸入泵、生物降解性微球、微乳、復乳、脂質體、納米粒和聚合物結合物。此外，對蛋白質分子進行化學修飾以抑制其清除，目前最常用的是聚乙二醇修飾。

       口服給藥

       蛋白質類藥物的口服給藥存在以下限制，1）被胃酸催化降解；2）被胃腸道內的酶水解；3）對胃腸道黏膜的透過性差；4）存在肝的首過效應。采用吸收促進和新型微粒給藥系統(tǒng)（如微乳、納米粒、脂質體）可提高其吸收。

       其他給藥途徑

       包括鼻腔給藥系統(tǒng)（鼻粘膜）、肺部給藥系統(tǒng)（肺粘膜）、直腸給藥系統(tǒng)、口腔黏膜和經(jīng)皮給藥系統(tǒng)。這些給藥途徑的優(yōu)點是均不同程度地避免了藥物的肝 臟首關效應，給藥部位蛋白水解酶的活性較低，藥物在給藥部位穩(wěn)定性增強，其中鼻粘膜和肺粘膜給藥吸收較快。共同的缺點是生物利用度較低。

       如何促進蛋白質類藥物的吸收

       提高吸收屏障的通透性

       加入化學類吸收促進劑，如脂肪酸、磷脂、膽鹽、苯基甘氨酸酰胺衍生物、酯和醚型的（非）離子表面活性劑、皂角苷類、水楊酸酯衍生物、梭鏈孢酸、甘草酸衍生物或二甲基-β-環(huán)糊精；或通過離子導入技術和脂質體載體技術提高通透性。

       降低吸收部位和吸收途徑肽酶的活性

       加入抑胰肽酶、桿菌肽、大豆酪氨酸抑制劑、硼酸亮氨酸、硼酸纈氨酸；分子結構修飾防止降解；延長作用時間，如采用生物粘附技術。

       03  生物技術藥物制劑質量評價的方法

       化學藥品一般具有純度很高，終產(chǎn)品中雜質可以分析、確定且制訂限量，產(chǎn)品相對穩(wěn)定的特點，因此可以通過對其最終產(chǎn)品的質量檢測實現(xiàn)對化學藥品的全面質量控制。大多數(shù)生物技術藥物目前上不可能做到這些。

       蛋白多肽類藥物的質量評價特點

       為了保證生物技術藥物產(chǎn)品的安全、有效、可控，必須從原料（包括菌、毒種）、生產(chǎn)工藝、半成品到成品進行全程的質量控制。蛋白質、多肽類藥物除對成品進行質量控制外，還應對中間半成品進行質量控制，并有相應的質量控制標準，生物技術藥物一般不以原料藥的形式批準上市；但例外的類別是胰島素，因其可形成晶態(tài)，在一定條件下可穩(wěn)定保存。當然，隨著液相及固相蛋白合成技術的進步與成熟，目前肽類藥物的質量標準將在既往的基礎上又明顯提高。

       生物技術藥物的質量控制

       傳統(tǒng)的生物技術藥物大多由活生物體（細菌或細胞）制備，具有復雜的分子結構，其生產(chǎn)涉及諸多生物學過程，如發(fā)酵、細胞培養(yǎng)、目的產(chǎn)物的分離純化等，在這些生產(chǎn)過程中，目標產(chǎn)品容易受到各種生物或理化條件等的影響，因此質量控制標準與檢測方法在生物技術藥物研發(fā)中占有舉足輕重的位置。上游工作構建、篩選得到的候選目標產(chǎn)品需要在建立檢測控制方法和質控標準后逐步確定中試工藝，而完成**評價、藥動學、藥效學研究等臨床前評價研究則需要工藝穩(wěn)定、符合質控標準的供試樣品，才能得到相對客觀、重現(xiàn)性好的評價數(shù)據(jù)；同時中試工藝等下游工作和臨床前評價研究所反映出的供試樣品問題，可以促進檢測控制方法和質控標準的完善與提高，以進一步優(yōu)化制備工藝，并積極推動申請臨床研究的進程。

       生物技術藥物質量控制主要包括理化特性分析、生物學活性測定、殘留雜質檢測和制劑相關的安全性及常規(guī)檢定等幾個方面。這里以基因工程蛋白質類生物技術藥物的質量控制為例加以介紹。

       理化性質鑒定

       理化性質鑒定包括特異性、分子量、等電點、肽圖、吸收光譜、氨基酸序列等。特異性鑒定是利用蛋白的抗原性，根據(jù)抗原抗體特異反應對特定產(chǎn)品進行鑒別，包括免疫印跡、免疫電泳、點免疫、免疫擴散等方法。蛋白質分子量常采用質譜法和還原型SDS-PAGE電泳法測定。等電點一般采用等電聚焦電泳或毛細管電泳法測定，并與標準品或理論值比較。重組蛋白質的等電點往往是不均一的，但重要的是在生產(chǎn)過程中批與批之間的電泳結果應一致，以反映其生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。等電點呈現(xiàn)多區(qū)帶往往是產(chǎn)品結構不均一的表現(xiàn)，如二硫鍵配對錯誤、構型改變、C端降解等。肽圖分析是指通過化學裂解法及蛋白酶裂解等各種手段，將蛋白斷裂成大小不均的多個肽段，通過SDS-PAGE電泳、反相HPLC、毛細管電泳、質譜分析等各種手段分離檢測，對空間構象較復雜，或因裂解不完全、二硫鍵仍然將各個片段連接在一起的特殊產(chǎn)品，則先用還原劑打開二硫鍵、封閉巰基后再按照常規(guī)方法進行分析。通過與天然產(chǎn)品或參考品的蛋白質一級結構作精密比較，肽圖分析可確證表達產(chǎn)物結構的正確性以及批件產(chǎn)品結構的吸收波特征，符合280nm左右紫外特征吸收峰。N末端氨基酸序列分析是重組蛋白質和肽的重要鑒別標準，一般要求至少測15個氨基酸。有的蛋白質以單鏈和從中間斷裂后形成鏈形式存在，這種情況就會測出兩個不同的N末端，所以在質量標準中根據(jù)理論值可分別設定N末端為標準。N末端測序的基本原理為Edman化學降解法，目前已用蛋白質全自動測序儀進行N-端氨基酸序列測定，靈敏度已達到pmol水平。

       生物活性、比活性測定

       生物學活性測定是重組蛋白質類藥物重要的質控指標，包括體外測定法、體內測定法、酶促反應測定法和免疫學活性方法等。體外測定法是指重組蛋白質類藥物對培養(yǎng)細胞和離體動物器官生物學功能的影響；體內測定法是利用動物體內某些指標的變化確定產(chǎn)品的生物學活性單位；生化酶促反應測定法主要分析產(chǎn)品與底物或某種物質結合后發(fā)生的物理化學反應，如重組鏈激酶溶栓活性測定，即利用其于纖溶酶原結合后可激活纖溶酶，從而在纖維蛋白瓊脂平板中形成溶圈；免疫學活性測定法采取酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等方法測定產(chǎn)品活性。蛋白質的生物學活性與其免疫學活性不一定相平行，只有蛋白肽鍵的抗原決定簇和生物活性中心相一致，ELISA法測定結果才能反映生物學活性。

       比活性是每毫克蛋白質的生物學活性單位，是進行成品分裝的重要依據(jù)。蛋白質的空間結構不能常規(guī)測定，蛋白質空間結構的改變特別是二硫鍵的錯誤配對可影響蛋白質的生物學活性，從而影響蛋白質類藥物的藥效，比活性可間接地反映這一情況。通過對原料藥比活性的檢測，不僅可反映產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，而且還可以比較不同表達體系、不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)同一產(chǎn)品時的質控情況。一般比活性的標準可根據(jù)中試工藝優(yōu)化后的多次檢定結果統(tǒng)計后定出。

       純度分析

       重組蛋白純度分析一般采用HPLC和SDS-PAGE方法。進行SDS-PAGE分析時，結果應顯示單一條帶，純度一般應大于95%。HPLC法應根據(jù)不同的純化工藝選擇不同的方法，一般盡量采用與SDS-PAGE法原理不同的反相柱或其他離子交換柱進行分析。進行HPLC分析時結果應呈單一峰，經(jīng)積分計算產(chǎn)品純度一般大于95%。如出現(xiàn)主峰以外的其他相關物質峰，則應對雜峰的性質進行分析。必要時，還需要采用適宜的方法測定相關蛋白（如異構體或缺失體）的含量，并制定對應的限量標準。

       含量測定

       蛋白質含量測定是生物技術藥物質量控制的重要指標之一，其準確性對產(chǎn)品規(guī)格、分裝量具有指導意義，是比活性計算、殘留雜質的限量控制以及其他理化特性測定的基礎，也是臨床前安全和有效性評價研究中有效劑量、**劑量設置以及臨床方案制訂的重要依據(jù)。測定方法包括凱氏定氮法、Lowry法、BCA法、染色法、紫外吸收法、ELISA法和HPLC法等。其中Lowry法是經(jīng)常使用的方法。

       二硫鍵分析

       二硫鍵形成是一種常見的蛋白質翻譯后修飾，對穩(wěn)定蛋白質的空間結構，保持及調節(jié)其生物活性有非常重要的作用。因此，確定二硫鍵在蛋白質中的位置是全面了解含二硫鍵蛋白質化學結構的重要方面。

       目前常用的定位二硫鍵的方法分為非片斷法和片斷法。非片斷法包括X射線衍射晶體結構分析法、多維核磁共振波譜法和合成對照法等。片斷法包括對角線法、二硫鍵異構及突變分析法、酶解法和化學裂解法、部分還原測序法以及氰化半胱氨酸裂解法等。這些方法各具特點，也有各自的局限性。隨著質譜儀器在質量檢測范圍、分辨率、靈敏度、準確度和分析速度等方面的不斷發(fā)展，使質譜法更加適合二硫鍵的分析。二硫鍵的定位現(xiàn)多采用生化、質譜及測序等多種方法相結合來進行。

       殘余雜質檢查

       殘余雜質可能具有**，也影響產(chǎn)品的生物學活性或使產(chǎn)品變質，可反映產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。殘余雜質可分為外來污染物和產(chǎn)品相關的雜質兩大類，外來污染物包括微生物污染、熱源、細胞成分（例如細胞蛋白質、DNA等）、培養(yǎng)基中的成分、來自生產(chǎn)過程的物質；殘留雜質限度設定是控制質量的重要手段。

       制劑相關的安全性及常規(guī)檢定

       重組蛋白質藥物制劑相關的安全性及常規(guī)檢定一般包括外觀、裝量、pH、水分、無菌實驗、異常**等。凍干是保證產(chǎn)品有效期內穩(wěn)定性的重要工藝。水分檢測主要針對凍干制劑，目前水分國際公認標準為不超過3.0%，所采用的方法有化學法（Fischer法）和稱量減重法。近年來也有一些基因工程藥物采用水針劑性，需要提供穩(wěn)定性試驗的資料，以證明在有效期內生物學活性不會明顯降低；如果添加了其他化學穩(wěn)定劑，也要提供安全性的資料。裝量實驗、pH檢測和無菌實驗對凍干制劑、水針劑性都是必要的。注射用制品無菌實驗有增菌培養(yǎng)法和濾膜法，口服或外用制劑菌檢項目有需氧菌、厭氧菌、真菌和支原體。異常**試驗是主要檢查生產(chǎn)工藝中是否含有目標產(chǎn)品意外的有毒物質。上市外觀、裝量、pH、水分、無菌實驗、異常**等檢測方法按《中國藥典》規(guī)定的標準進行。

       小結

       以上不難看出，生物技術藥物與化學藥物相比較，藥學研究方面存在很多不同之處，其所關注的質量控制的項目和關鍵點，對于化學藥開發(fā)人員來說，概念還是比較模糊的。且當前所公開公布的生物藥藥學研究資料相對較少，遠不如化學藥藥學研究資料之多。但生物技術藥物的發(fā)展已經(jīng)與化學藥并列前行，理解生物藥藥學研究可以更好使我們理解藥物。筆者也是本著學習的態(tài)度，在接下來的文章中，將繼續(xù)介紹生物技術藥物的臨床前藥理毒理評價，及藥動學信息，以期與大家共同進步。

       參考：

       1. 《藥品注冊管理辦法》

       2. 《新藥研究與評價概論》.李曉輝，杜冠華。

       3. 《化學藥品和治療用生物制品研究指導原則-試行》

       4. 《生物類似藥研發(fā)與評價技術指導原則（試行）》2015

       5. 生物類似藥研發(fā)相關問題問與答. CDE官網(wǎng)