1. 甲基化研究的意外發(fā)現(xiàn)

       像弗萊明偶然發(fā)現(xiàn)了青霉素一樣，RNA激活現(xiàn)象也是偶然中發(fā)現(xiàn)的。那時，李龍承博士正在加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）從事腫瘤DNA甲基化的研究。在腫瘤細(xì)胞中，許多抑癌基因因為啟動子區(qū)發(fā)生高度甲基化而失活，導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生，這在當(dāng)時是很熱門的研究領(lǐng)域。在研究了大量的抑癌基因后，一個現(xiàn)象讓李博士很是不解，就是同一個抑癌基因在有的腫瘤中存在甲基化失活，而有的腫瘤沒有；而在同一種腫瘤中，有的抑癌基因被甲基化沉默了，有的又沒有。到底是什么信號決定了哪些基因被甲基化和基因的哪些位置發(fā)生甲基化呢？

       2004年，李博士注意到植物細(xì)胞中存在一種雙鏈RNA（dsRNA）通過Argonaute蛋白途徑介導(dǎo)DNA甲基化（RDDM，RNA DirectedDNA methylation）的現(xiàn)象。受這一現(xiàn)象的啟發(fā)，李博士開始研究人類細(xì)胞中是否存在相同的機制。為此，李博士設(shè)計了兩條針對鈣粘素E基因啟動子區(qū)的dsRNA，希望這兩條dsRNA能夠作為一種信號分子，指導(dǎo)細(xì)胞對靶點區(qū)域的DNA進行甲基化，進而下調(diào)鈣粘素E基因的表達。然而，意外發(fā)生了。鈣粘素E基因的表達不僅沒有下調(diào)，反而提高了很多。剛開始李博士也以為是實驗操作中出錯了，但是后續(xù)多次重復(fù)實驗仍舊是相同的結(jié)果，使得他們初步確認(rèn)一個新的基因調(diào)控機制被發(fā)現(xiàn)了。之后李博士的實驗室在多個基因上都發(fā)現(xiàn)了同樣的dsRNA激活基因表達的現(xiàn)象，最終于2006年確認(rèn)了這是獨立于RNAi的一種小RNA指導(dǎo)的基因調(diào)控方式---RNA激活（RNA activation，簡稱RNAa）。

       熟悉核酸技術(shù)發(fā)展史的人們應(yīng)該記得，2006年，當(dāng)時在華盛頓卡內(nèi)基研究所的Andrew Fire和馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Craig Mello因為發(fā)現(xiàn)RNAi機制而分享了當(dāng)年的諾貝爾獎?？赡苁且驗镽NAi技術(shù)風(fēng)頭正健，也可能是因為這種現(xiàn)象太不可思議，有關(guān)RNAa現(xiàn)象文章的發(fā)表并不順利。歷經(jīng)Science和Nature多次修稿和拒稿之后，終于在RNAi技術(shù)獲得諾獎的同一年發(fā)表于美國科學(xué)院院刊（PNAS）。有趣的是，RNAa現(xiàn)象是首先在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，時隔七年之后的2013年，Craig Mello實驗室和其他幾個實驗室在線蟲中也觀察到了RNAa現(xiàn)象的存在，證明了RNAa在物種之間的保守性。眾所周知，很多基礎(chǔ)的生物學(xué)現(xiàn)象都是在低等的模式動物如線蟲、斑馬魚等中發(fā)現(xiàn)的，然后在高等動物中得到驗證。而RNAa的發(fā)現(xiàn)和驗證整好是相反的過程，這就說明科學(xué)研究的路徑不是一成不變的。當(dāng)有新的現(xiàn)象被揭示時，要有坦然接受的能力。
 

       2. RNAa作用機制

       時至今日，關(guān)于RNAa的研究越來越多，它的神秘面紗逐步被揭開。當(dāng)dsRNA（被稱為saRNA，小激活RNA）裝載到Argonaute2（Ago2）蛋白后，其中的一條鏈（通常被稱為“過客鏈”，另一條鏈被稱為“引導(dǎo)鏈”）被Ago2從中間切斷并從Ago2復(fù)合體中脫落。之后Ago2復(fù)合體通過主動轉(zhuǎn)運機制進入細(xì)胞核，其與RNA helicase A （RNA解旋酶A，RHA）相互作用形成Ago2-RHA復(fù)合體，復(fù)合體開始在染色體上尋找與引導(dǎo)鏈互補的基因序列。一旦找到互補的基因序列并與之結(jié)合，Ago-2-RHA復(fù)合體招募polymerase-associated factor 1（聚合酶相關(guān)因子1，PAF1）形成RITA（RNA-induced transcriptional activation，RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活）復(fù)合體，該復(fù)合體進一步招募和激活RNA polymerase II（RNA聚合酶II），導(dǎo)致mRNA表達的增加。具體的通路如下圖所示。

圖1 RNAa作用機制 （來自參考資料1）
 

       3. RNAa應(yīng)用，大有可為

       人類基因組計劃（human genome project，HGP）完成后，后基因組時代已然來臨。發(fā)現(xiàn)新基因、鑒定基因功能以及基因之間相互關(guān)系是后基因組時代的重要課題。由于saRNA誘導(dǎo)的基因激活具有高特異性、高效性和方便性，因此作為一種遺傳學(xué)技術(shù)應(yīng)用于基因功能研究，對于研究基因的致病機理、藥物作用機制等具有重要意義。

       而RNAa作為一種稀缺的能夠做“加法”的技術(shù)，我們預(yù)計其在疾病治療領(lǐng)域，會有更廣闊的天地。表1根據(jù)美國FDA批準(zhǔn)的藥物統(tǒng)計了目前所有成藥的靶點，包括小分子藥物靶點749個，生物制品靶點179個；其中蛋白型靶點856個，非蛋白型靶點37個。蛋白質(zhì)之所以成為藥物靶點的主要類型，是因為蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)提供了藥物結(jié)合的位點。這也是目前小分子和抗體藥物面臨的困境，他們的繼續(xù)開發(fā)依賴于蛋白結(jié)構(gòu)的深入研究并且受到蛋白自身結(jié)構(gòu)的限制。而核酸藥物則不受這種限制。人類的39000多個基因，都有可以成為核酸藥物的靶點。正是得益于這種優(yōu)勢，RNAa療法幾乎可以應(yīng)用于我們能夠想到的任何疾病領(lǐng)域。例如，在腫瘤領(lǐng)域，可以通過激活抑癌基因?qū)崿F(xiàn)治療腫瘤的目的；在心血管領(lǐng)域，可通過激活VEGF治療缺血性疾?。粚τ诟腥拘约膊?，有人嘗試用RNAa機制激活潛伏的HIV-1病毒來達到根除病毒感染的目的。

       實際上，RNAa療法在單基因遺傳病方面，尤其是單等位突變導(dǎo)致的基因表達不足而引發(fā)的罕見病方面有其特別的優(yōu)勢。對于這類蛋白功能缺失性疾病，雖然基因治療已經(jīng)成藥，但開發(fā)難度極大且有潛在的較為嚴(yán)重的副作用。作為一種簡便的靶向基因開啟技術(shù)，RNAa療法有可能在罕見病領(lǐng)域大放異彩。

       表1 FDA批準(zhǔn)藥物對應(yīng)靶點數(shù)目匯總

來自參考資料2
 

       4. RNAa可能面臨與RNAi不同的成藥挑戰(zhàn)

       目前，已經(jīng)有兩款siRNA藥物上市，而作為與siRNA結(jié)構(gòu)類似、功能相反的saRNA進展最快的仍處于二期臨床階段。與siRNA相比，saRNA發(fā)揮作用還需要穿透核膜，這樣看來saRNA似乎比siRNA的遞送更具有挑戰(zhàn)性。目前我們已知saRNA從胞質(zhì)到胞核是一個主動轉(zhuǎn)運的過程，也就是說saRNA只要能跨膜進入細(xì)胞質(zhì)，剩下的入核過程可以交給細(xì)胞內(nèi)源的機制去完成。而與siRNA作用于mRNA相比，saRNA的靶點是DNA，其在每個細(xì)胞中的拷貝數(shù)（2個）明顯低于mRNA（幾百上千），加上saRNA對表觀遺傳產(chǎn)生影響，具有長效性，所以實際上在核內(nèi)發(fā)揮作用的saRNA劑量可大大低于siRNA。即便是考慮細(xì)胞核對雙鏈核酸的外排作用，我們?nèi)匀豢梢酝茰ysaRNA發(fā)揮作用并不會面臨比siRNA更大的障礙。當(dāng)然最終的結(jié)論還是需要更多的實驗，甚至臨床結(jié)果去驗證。
 

       5. UCSF的專利輾轉(zhuǎn)

       早在2005年9月，加州大學(xué)就遞交了關(guān)于RNAa作用機理的美國臨時專利申請，期望獲得RNAa的機制保護及saRNA在基因激活應(yīng)用方面的保護。2008年，RNAi領(lǐng)域的領(lǐng)頭羊公司Alnylam取得了該技術(shù)的許可使用權(quán)，開始進行saRNA藥物研究，這是RNAa療法最早的商業(yè)開發(fā)。遺憾的是，siRNA藥物開發(fā)初期由于遞送和免疫反應(yīng)的問題屢遭挫折，跨國藥企紛紛離場，導(dǎo)致Alnylam自己都艱難度日。最終Alnylam還是決定聚焦于siRNA，暫時放棄saRNA藥物開發(fā)，saRNA技術(shù)的許可使用權(quán)也于2012年被加州大學(xué)收回。

       Dr. Nagy是英國MiNA公司的創(chuàng)始人，本身也是一位多產(chǎn)的發(fā)明家，擁有很多外科器械方面的發(fā)明，同時在基因治療、干細(xì)胞治療、內(nèi)窺鏡檢查和外科手術(shù)方面發(fā)表了廣泛的著作。2012年的美國小核酸治療協(xié)會年會上，Nagy聽到了李龍承博士關(guān)于RNAa技術(shù)的報告，馬上意識到這是一個很有開發(fā)前景的技術(shù)。Nagy迅速與加州大學(xué)聯(lián)系，在2014年取得RNAa技術(shù)的許可使用權(quán)，并于2016年開始進行全球第一款saRNA藥物的臨床研究。光一樣的速度！

       作為RNAa技術(shù)的開拓者，李龍承博士很早就意識到其在制藥領(lǐng)域的無限潛力。2008年，舊金山灣區(qū)著名的生物醫(yī)藥風(fēng)險投資公司Alta Partners計劃支持李博士成立初創(chuàng)公司開發(fā)RNAa技術(shù)。因為當(dāng)時加州大學(xué)已經(jīng)決定將該技術(shù)授權(quán)給Alnylam，這一計劃最終夭折。2015年，加州大學(xué)專利獲得授權(quán)，他們最初設(shè)計的RNAa機理的保護并沒有得到支持，獲得保護的只是有限的靶點和具體的saRNA序列。這對于其他靶點和序列的開發(fā)并沒有限制作用。李龍承博士終于可以自由開發(fā)由他自己開創(chuàng)的技術(shù)，中美瑞康公司（Ractigen）應(yīng)運而生。接下來我們擬對全球唯二的RNAa療法公司---英國MiNA和中國Ractigen進行解讀。
 

       參考資料

       1. Treating disease at the RNA level witholigonucleotides, Arthur A. Levin, N Engl J Med, 2019;380:57-70

       2. A comprehensive map of molecular drug targets,Rita Santos, et al, Nat Rev Drug Discov. 2017;16(1):19-34