雖然接種**是防控新冠疫情的最有效手段，但面對新的Omicron變異毒株，大多數(shù)**和中和抗體的保護效果明顯降低。開發(fā)新的廣譜抗病毒療法對于治療COVID-19仍具有重要意義。新冠病毒的RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp）、PLpro（木瓜蛋白酶樣蛋白酶）、3CLpro蛋白酶（主蛋白酶Mpro）及解旋酶等病毒蛋白酶是主要的藥物靶點。默沙東與Ridgeback聯(lián)合開發(fā)的RdRp抑制劑Molnupiravir和輝瑞公司的主蛋白酶抑制劑Paxlovid（主要成分為PF-07321332及Ritonavir）均已通過FDA的緊急使用授權。今天我們通過來回顧Paxlovid的發(fā)現(xiàn)和研發(fā)過程。
SARS-CoV-2基因組編碼pp1a和pp1ab兩種多聚蛋白以及四種結構蛋白。SARS-CoV-2的主蛋白酶可在11個不同位點切割多聚蛋白，產(chǎn)生對病毒復制至關重要的非結構蛋白。冠狀病毒的主蛋白酶是一種具有三結構域的半胱氨酸蛋白酶，其特征是位于結構域I和II之間具有Cys145-His41催化二聯(lián)體。主蛋白酶的底物共同特征是P1處存在Gln殘基，而已知的人類半胱氨酸蛋白酶均沒有在Gln后裂解，因而這為主蛋白酶作為抗病毒 藥物靶標提供了潛在選擇性。鑒于病毒蛋白酶小分子口服抑制劑在HIV和HCV治療中取得的成功，以及SARS-CoV-2主蛋白酶在病毒復制中的關鍵作用，主蛋白酶Mpro成為RdRp之外另一個研究熱點。靶向主蛋白酶的藥物開發(fā)主要集中在底物位點、變構位點和二聚化界面。
由于SARS-CoV-1和SARS-CoV-2的主蛋白酶底物結合位點具有100%的序列同源性，輝瑞2002年針對暴發(fā)的SARS疫情發(fā)現(xiàn)的SARS-CoV-1主蛋白酶抑制劑PF-00835231（化合物1）對SARS-CoV-2主蛋白酶也具有很強的抑制活性，在細胞水平表型出較強的抗SARS-CoV-2病毒活性。
化合物1的透膜性和口服生物利用度較差，為了克服這一問題，研究人員嘗試減少P1’位的氫鍵供體，分別引入氰基和苯并噻唑-2-基酮兩種共價靶頭。引入氰基的化合物2在大鼠體內(nèi)口服吸收顯著提高，且保持了較好的代謝穩(wěn)定性，但體外對主蛋白酶的抑制作用及抗SARS-CoV-2病毒活性均降低。在P1’位引入苯并噻唑-2-基酮、P2位引入環(huán)狀亮氨酸擬肽類似物后得到化合物3可顯著提高透膜性，對主蛋白酶抑制作用降低主要是由于缺少了抑制劑與Gln189之間的氫鍵相互作用。為了更好地占據(jù)S3口袋，研究人員在P3位引入支鏈非環(huán)狀基團。引入甲磺酰胺封端得到的化合物4伸向Gln189下方，增強與P3口袋殘基的結合，提高與Glu166骨架的氫鍵相互作用。與化合物3相比，化合物4對主蛋白酶的體外抑制活性，對SARS-CoV-2的抗病毒活性以及口服吸收均得到提高。對P3位封端進行優(yōu)化，得到三****封端的化合物5，保持了對主蛋白酶的抑制作用，提高了抗SARS-CoV-2病毒活性、透膜性、代謝穩(wěn)定性和口服生物利用度。將P1’位換成氰基后得到化合物6（PF-07321332），對主蛋白酶的體外抑制活性進一步提高，保持了抗SARS-CoV-2病毒活性和代謝穩(wěn)定性，提高了大鼠口服生物利用度。通過稀釋實驗證明PF-07321332是SARS-CoV-2主蛋白酶的可逆性共價抑制劑。與化合物5相比，因PF-07321332更易于合成放大，且溶解性提高，易于制劑給藥，故作為臨床候選藥物開發(fā)。
PF-07321332對所有已知可感染人類的冠狀病毒的主蛋白酶均具有較強的體外抑制活性，而對哺乳動物的半胱氨酸、絲氨酸和天冬氨酸蛋白酶沒有明顯抑制活性。PF-07321332在生理相關的A549和dNHBE細胞模型中也具有強大的抗病毒活性，在細胞病變實驗（CPE）中對SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS及人冠狀病毒229E均具有強大的抗病毒活性。
在小鼠體內(nèi)，PF-07321332在300 mg/kg給藥劑量下血漿未結合藥物濃度即可長時間維持在體外細胞實驗的EC90以上。在SARS-CoV-2小鼠模型中，PF-07321332可保護小鼠因感染病毒導致的體重降低，抑制病毒復制，顯著降低小鼠肺部病毒水平，降低肺部病理損傷。PF-07321332在大鼠和猴體內(nèi)靜脈給藥后的半衰期分別為5h和＜ 1h。在大鼠和猴體內(nèi)的2周重復給藥**實驗中，PF-07321332的體內(nèi)暴露具有良好的劑量相關性，耐受性良好，未見明顯不良反應。
由于CYP3A4是PF-07321332的主要代謝酶，而CYP3A4的強效抑制劑Ritonavir（RTV）在臨床上可作為多個經(jīng)CYP3A4代謝的蛋白酶抑制劑（如Darunavir、Lopinavir等）的藥代動力學增強劑，因此，在健康成人受試者中進行的隨機、雙盲、安慰劑對照的單次劑量爬坡試驗中，考察了PF-07321332單用、與RTV合用（Paxlovid）兩種方式，PF-07321332的安全性和耐受性良好，在與RTV合用后，口服血液濃度顯著提高，在給藥后12h，仍維持在體外抗SARS-CoV-2病毒EC90以上，因此，Paxlovid有望在臨床上取得強大的廣譜抗冠狀病毒活性。
綜上所述，PF-07321332可口服給藥，具有良好的選擇性和安全性，并可在小鼠模型中防止感染。在I期臨床試驗中，該藥物達到了預期的抑制病毒作用濃度。因此，主蛋白酶抑制劑Paxlovid與RdRp抑制劑Molnupiravir、**聯(lián)合，有可能進一步增強對新冠病毒疫情的防控。
參考文獻
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