藥物發(fā)現(xiàn)既昂貴又耗時。盡管在研發(fā)方面投入了大量資金，但自20世紀90年代以來，美國食品和藥物管理局（FDA）批準的平均藥物數(shù)量一直在下降。目前，每個被批準的新分子實體的研發(fā)成本約為18億美元，再加上專利到期，使制藥公司面臨著艱巨的任務——開發(fā)更多的產(chǎn)品以維持其創(chuàng)新。此外，藥物發(fā)現(xiàn)失敗率的升高會降低對衍生化合物、微小配方變化或藥物組合的原創(chuàng)研究熱情。

       決定藥物發(fā)現(xiàn)成功的重要因素之一是體內(nèi)藥物動力學。這是指藥物與其靶點的結合動力學，包括結合和解離時間，這會影響藥物在體內(nèi)的停留時間。隨著制藥公司更多地關注于優(yōu)化靶點結合親和力和選擇性，藥物動力學往往不被重視，盡管越來越多的證據(jù)表明動力學參數(shù)與藥物療效的相關性可能比親和力參數(shù)更強。在此，本文將討論用于研究藥物動力學的實驗和建模方法，以及如何利用它們來提高藥物發(fā)現(xiàn)的成功率。

       01 動力學的重要性

       藥物發(fā)現(xiàn)通常是通過在恒定藥物濃度下通過一系列體外實驗來識別和優(yōu)化先導化合物。這些實驗產(chǎn)生均衡量化指標，包括半數(shù)抑制濃度（IC50）和平衡解離常數(shù)（KD），用于預測藥物活性。

       然而，當藥物進入人體時，由于胃腸道吸收、腎 臟排泄和代謝等生理過程，它們的濃度會不斷變化。因此，越來越多的人認識到，基于均衡（equilibrium）的模型來評估藥物-靶點相互作用，對體內(nèi)藥理學的預測性較差，而能夠捕捉藥物動力學的模型更適用于描述體內(nèi)非均衡情況下的動態(tài)藥物-靶點相互作用。

       02 結合及解離速率

       表征動態(tài)藥物相互作用的2個最基本的單位是結合速率常數(shù)（association rate constant/on-rate，kon）和解離速率常數(shù)（dissociation rate constant/off-rate，koff）。當一起使用時，這些參數(shù)可以洞察藥物-靶點復合物的分子識別和穩(wěn)定性。研究表明，藥物停留時間（RT=1/koff是藥物療效和選擇性的關鍵預測因子，因為停留時間較長的藥物能夠通過減少靶點占有率的下降而產(chǎn)生更持久的作用，靶點占有率用于描述配體分子對靶點占據(jù)的程度。

       雖然關于koff和如何減少koff的研究已經(jīng)很多，但關于koff及其對體內(nèi)靶點占有率的影響的數(shù)據(jù)相對較少。有趣的是，Zhou與其同事們（doi:10.1002/psp4.12035）發(fā)現(xiàn)，與流行的觀念相反，增加kon可以延長靶點占有時間。這一發(fā)現(xiàn)表明了優(yōu)化kon和koff的重要性。

       IJzerman和Guo認為，對kon的研究不那么重視的一個原因是對度量的普遍假設存在疑問。20世紀90年代初，Smoluchowski開發(fā)了一種數(shù)學方法來建模生物分子反應，例如受體和配體之間的分子反應。該模型適用于各向同性、非相互作用的球體，其中kon僅取決于分子的大小及其溶劑的粘度，即擴散受限。然而，當涉及到具有立體特異性的藥物-靶點相互作用的建模時，假設kon不變且擴散受限就不再有用了。例如，如果一個配體只能在特定的位置和方向上與其受體結合，kon就會顯著下降。另一方面，有利的靜電吸引可以顯著增加kon。

       03 實驗工具

       據(jù)了解，有多種技術可以測量kon和koff，最古老的方法之一是放射配體結合分析法，但它存在一些局限性，例如難以將**標記配體與游離配體分離。這種分析法也忽略了由于配體結合而在受體中可能發(fā)生的構象變化，G蛋白偶聯(lián)受體就是這樣一個例子。

       一種流行的、無標記的方法是表面等離子體共振（SPR），其中藥物-靶點復合物的形成會導致偏振光的折射率變化。它的優(yōu)點是試劑和樣品消耗量低，不需要標記，可以實時提供數(shù)據(jù)。SPR可用于測量各種分子之間的生物分子相互作用，包括蛋白質(zhì)、離子和片段。然而，由于配體是分批測量的，通量仍然很低。此外，研究膜結合蛋白可能是一個挑戰(zhàn)，因為偏離天然構象的蛋白質(zhì)可能與其靶點具有不同的相互作用。此外，蛋白質(zhì)需要穩(wěn)定地結合到等離子體芯片上，這可能會限制這種方法的適用性。

       可以說，目前使用最廣泛的技術是熒光共振能量轉移（FRET）和生物發(fā)光共振能量轉移（BRET），因為它們具有高靈敏度、與活細胞狀態(tài)的相容性，并且能夠通過商業(yè)設計熒光探針用于多種蛋白質(zhì)。

       這2種方法的機理相似，依賴于能量從供體分子到受體分子的距離依賴性轉移。為了使FRET和BRET能夠很好地工作，供體和受體分子必須非常接近（分別為10–100Å和10nm）。在FRET中，分子之間也必須有光譜重疊。與FRET不同，BRET不需要外部光源來激發(fā)供體分子。因此，它具有非常低的干擾背景信號，例如與FRET相關的自發(fā)熒光、光散射和光漂白。

       其他新興的方法包括石英晶體微天平，它可以檢測由于配體與細胞結合而引起的質(zhì)量變化，以及熒光相關光譜術，它可以測量粒子熒光強度的波動，其中自由配體可以與緩慢擴散的受體結合配體區(qū)分開來，而無需物理分離。等溫滴定量熱法（ICT）可實時測量生化反應引起的熱變化，并可直接讀出酶活性對抑制劑結合的響應。例如，熱信號的變化速率與抑制劑與酶的結合速率相關，這使我們能夠計算結合速率常數(shù)。雖然ICT在藥物動力學方面的應用受到限制（大部分應用是在熱力學方面），但該技術已被用于確定共價和非共價抑制劑與脯氨酰寡肽酶（POP）的結合動力學參數(shù)，后者是治療癌癥和神經(jīng)退行性疾病的一個有希望的靶點。

       對藥物動力學的日益重視導致了由歐洲創(chuàng)新藥物計劃（Innovative Medicines Initiative，IMI）與大型制藥公司共同資助的K4DD（Kinetics for Drug Discovery，藥物發(fā)現(xiàn)動力學）項目的誕生。該項目的一個主要發(fā)現(xiàn)是結合和解離速率常數(shù)受配體結構的強烈影響。讀者可以參考ChEMBl數(shù)據(jù)庫（https://www.ebi.ac.uk/chembl/）了解生物活性化合物的結構=動力學關系。

       04 計算建模工具

       隨著X射線晶體學和電子顯微鏡的進步，對藥物-靶點相互作用動力學的分子理解有所提高。利用所得數(shù)據(jù)，研究人員開發(fā)了計算模型，以了解定量結構動力學關系（QSKR）。這些模型通常使用統(tǒng)計機器學習來獲得藥物-靶點復合物的結構信息或者使用增強采樣的分子動力學模擬來建立。研究人員還將人工智能與分子模擬相結合，例如，Ribeiro等人利用神經(jīng)網(wǎng)絡從無偏分子動力學中學習，然后創(chuàng)建了一個新框架來研究苯與溶菌酶的解離，這是一種十分受歡迎的常被研究的配體-蛋白質(zhì)復合物。

       例如，苯的離解會在溶菌酶中形成一個空腔，從而影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)，如變性溫度和與特定配體的結合。這為優(yōu)化蛋白質(zhì)工程創(chuàng)造了機會。Decherchi和Cavalli寫了一篇綜述，總結了分子模擬和取樣方法的進展。在他們的工作中，他們解釋稱，由于配體-蛋白質(zhì)結合和解除結合的時間尺度范圍很廣，因此分子模擬捕捉大分子的實時動力學仍然具有挑戰(zhàn)性。考慮到分子模擬中的時間步長為1飛秒，為了驗證毫秒或秒級的采樣事件，需要1012或1015個整合步驟，這超出了當前可用的計算技術。然后，作者總結了分子模擬對藥物動力學的貢獻，例如根據(jù)配體的藥物停留時間對其進行排序。

       05 展望未來

       人體是不斷變化的，因此捕捉動態(tài)藥物動力學是一項挑戰(zhàn)。這是復雜的，因為還有其他因素影響藥物動力學。例如，動力學選擇性，它指的是藥物結合選定靶點（chosen target）而非結合脫靶（off-target）的相對能力。該參數(shù)提供了對不想要的不利影響的洞察。動力學選擇性反過來又受到熱力學性質(zhì)的影響，例如吉布斯能（Gibbs energy）和結合焓（enthalpy of binding），它們提供了驅(qū)動藥物-靶點相互作用的分子間作用力的根本信息。

       進一步證實其重要性的是，動力學選擇性反過來會影響靶點易受攻擊性（target vulnerability），其定義為必須參與結合以引發(fā)所需響應的靶點比例。與高易受攻擊性靶點相比，低易受攻擊性靶點需要相對較高的藥物暴露水平，才能達到藥理學相關的靶點參與水平。這意味著，高易受攻擊性靶點受到動力學選擇性的強烈影響，因為產(chǎn)生一小部分活性靶點（例如靶點參與結合后通過藥物離解）需要更多時間。

       雖然預測藥物動力學是復雜的，但隨著實驗和建模方法的不斷改進，有望做出更好的預測來提高藥物的療效和安全性。

       參考資料：Andy Tay, PhD：Assessing Kinetics in Drug Discovery