CAR-T治療究竟貴在哪里。

       CAR-T療法：是指通過基因克隆技術(shù)對具有免疫球蛋白（Ig）的抗原結(jié)合區(qū)的T細(xì)胞受體進(jìn)行基因改造，將帶有特異性抗原識別結(jié)構(gòu)及T細(xì)胞激活信號的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入T細(xì)胞，使T細(xì)胞直接與腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原相結(jié)合而被激活。CAR識別腫瘤抗原后，激活T細(xì)胞的免疫通路，相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，分泌顆粒酶、穿孔素等物質(zhì)直接介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞溶解，同時(shí)分泌粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、干擾素-γ（IFNγ）等炎癥因子，招募巨噬細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞響應(yīng)殺傷腫瘤組織，從而治療癌癥。

       CAR分子結(jié)構(gòu)：CAR主要由識別腫瘤特異性抗原的單鏈抗體（scFV）段、鉸鏈區(qū)及跨膜段、共刺激分子結(jié)構(gòu)域、CD3ζ結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。通過將編碼CAR的基因引入T細(xì)胞，從最初一代CAR-T細(xì)胞發(fā)展到目前的第四代CAR-T細(xì)胞經(jīng)歷了30年的發(fā)展時(shí)間。

       圖1 CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)演變

       表1 四代CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)的發(fā)展

       01

       CAR-T制備流程復(fù)雜，耗時(shí)較長

       目前上市的CAR-T產(chǎn)品均為自體細(xì)胞來源，自體CAR-T制備首先將病人的白細(xì)胞（WBCs）通過血細(xì)胞去除法分離后洗滌獲得。然后，T細(xì)胞被激活，轉(zhuǎn)導(dǎo)CAR基因，擴(kuò)增到一定數(shù)量后罐裝和密封后用于治療。CAR-T細(xì)胞制備主要包括以下步驟：

       圖2 臨床規(guī)模自體CAR-T細(xì)胞療法的制備過程

       （1）單采白細(xì)胞及細(xì)胞清洗

       在CAR-T療法中患者的白細(xì)胞需要先被從體內(nèi)提取出來之后，對之加以改造使其表達(dá)CAR-T，而后再輸回患者體內(nèi)。由于白細(xì)胞重量異于其他血液成分，利用密度梯度離心法從患者（已上市產(chǎn)品）或健康志愿者（發(fā)展趨勢）外周血中分離白細(xì)胞，常用的血液成分分離機(jī)包括：Trima、UVAR-XTS、COBE Spectra，之后洗滌去除白細(xì)胞分離過程中添加的抗凝劑。

       （2）富集T細(xì)胞并激活

       生產(chǎn)CAR-T時(shí)所用的T細(xì)胞富集手段一般是單抗磁珠富集法，T細(xì)胞通過CD4/CD8特異性抗體或者表面標(biāo)記偶聯(lián)磁珠進(jìn)行分離，然后加入CD3/CD28單克隆抗體磁珠或人工抗原提呈細(xì)胞等對細(xì)胞培養(yǎng)基中的T細(xì)胞進(jìn)行激活，這其實(shí)是模擬正常身體環(huán)境中樹狀細(xì)胞對休眠T細(xì)胞的刺激，并使其迅速活化。因?yàn)閮H有活化后的T細(xì)胞能夠快速分裂，且T細(xì)胞僅在活化后方能針對某一特定抗原分泌大量抗體。

       （3）基因傳遞/轉(zhuǎn)染

       這是制備CAR-T的關(guān)鍵，使用慢病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或非病毒方法（電轉(zhuǎn)DNA、轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)）將CAR轉(zhuǎn)染到T細(xì)胞中，CAR基因是T細(xì)胞準(zhǔn)確識別腫瘤細(xì)胞的“眼睛”，載體的導(dǎo)入效率影響著CAR-T產(chǎn)品的成本和質(zhì)量。理想的載體應(yīng)具有較高的基因轉(zhuǎn)染效率，穩(wěn)定性好，不引起機(jī)體免疫反應(yīng)等特點(diǎn)，目前已開展的臨床試驗(yàn)以病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)為主。

       圖3 CAR基因的導(dǎo)入的主要方式

       γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是第一個(gè)用于人類的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，臨床應(yīng)用未發(fā)生與基因插入誘變相關(guān)的不良反應(yīng)，它屬于一種RNA病毒。首先需要通過將包裝有CAR基因序列和LTR序列、gag和pol基因系列、env基因系列的三個(gè)質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞，通過宿主細(xì)胞的細(xì)胞器復(fù)制/轉(zhuǎn)錄出病毒蛋白和所需的基因序列，并包裝成攜帶CAR基因的γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。載體和活化的T細(xì)胞膜融合后，釋放CAR基因，沿著微管被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核（得益于核膜被破壞），并整合進(jìn)T細(xì)胞基因組之后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)得到CAR蛋白。

       慢病毒載體相對γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)量更加，因而在臨床上應(yīng)用最多，但是由于二者為隨機(jī)整合，仍然存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)；慢病毒載體具有更高的寄送效率和T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)量，慢病毒傳染的CAR-T顯示出更顯著的抗腫瘤效力，是目前的主流遞送載體，轉(zhuǎn)染過程與逆轉(zhuǎn)錄病毒類似。可轉(zhuǎn)導(dǎo)靜止和活化的T細(xì)胞，轉(zhuǎn)到效率接近100%，轉(zhuǎn)基因負(fù)荷量可達(dá)8kb，基因**更小，整合位點(diǎn)相比γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒更安全但成本更高。

       目前絕大多數(shù)CAR-T細(xì)胞CAR的轉(zhuǎn)染都是基于病毒載體，但是病毒載體的制造過程復(fù)雜，成本昂貴且受到嚴(yán)格控制。監(jiān)管上病毒載體在臨床試驗(yàn)的早期階段難以符合GMP（藥物質(zhì)量管理規(guī)范）的所有方面。因此，以轉(zhuǎn)座子技術(shù)的非病毒基因傳遞是研發(fā)熱點(diǎn)，轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)發(fā)生基因整合具有一定的靶向性，且成本低，有較大的潛力發(fā)展成為臨床通用的T細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。轉(zhuǎn)座子基因載體由一個(gè)攜帶CAR（轉(zhuǎn)座子）的質(zhì)粒和一個(gè)攜帶轉(zhuǎn)座子酶的質(zhì)粒組成，質(zhì)粒經(jīng)電穿孔進(jìn)入T細(xì)胞，轉(zhuǎn)座酶被表達(dá)后作用于CAR側(cè)翼的末端導(dǎo)致重復(fù)序列，導(dǎo)致在T細(xì)胞基因組的TA二核苷酸序列上進(jìn)行切除和整合，插入CAR基因，轉(zhuǎn)錄表達(dá)后在細(xì)胞表面生成CAR。目前有基于Sleeping Beauty(SB，“睡美人”)轉(zhuǎn)座系統(tǒng)和基于PiggyBac(PB)的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)。

       mRNA電穿孔是將CAR基因?qū)隩細(xì)胞最簡單和最安全的方法，但是mRNA的不穩(wěn)定性要求進(jìn)行多次的T細(xì)胞輸注。

       表2 CAR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法對比

       （4）細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)

       通過生物反應(yīng)器等細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備對T細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。患者身上只能分離少量的淋巴細(xì)胞，大多數(shù)有白細(xì)胞減少癥和其他并發(fā)癥，需要將適宜的T淋巴細(xì)胞擴(kuò)增以達(dá)到治療目的。有許多患者最終無法接受CAR-T治療，原因就在于這些患者的T細(xì)胞無法在體外充分?jǐn)U增，未達(dá)到目標(biāo)劑量。CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增需要一個(gè)封閉、自動化和受控的擴(kuò)增平臺。細(xì)胞培養(yǎng)可以通過不同的容器進(jìn)行擴(kuò)增，包括T瓶、平板或培養(yǎng)袋以及生物反應(yīng)器。利用搖擺式生物反應(yīng)器（例如WAVE）進(jìn)行擴(kuò)增是目前主要的培養(yǎng)方式，除此之外，自動化的細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)設(shè)備（例如CliniMACS Prodigy）也能夠產(chǎn)生大量的CAR-T，這種自動化的設(shè)備比起搖擺式生物反應(yīng)器大大減少人為操作。

       圖4 T細(xì)胞培養(yǎng)過程

       （5）冷凍及運(yùn)輸，最終回輸患者

       根據(jù)配方調(diào)整細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)基成分，然后將產(chǎn)品轉(zhuǎn)移到合適的容器中進(jìn)行冷凍及運(yùn)輸，最終回輸?shù)交颊?。將?fù)制擴(kuò)增好的T細(xì)胞用靜脈輸液的方式輸入患者體內(nèi)，有效增加血液內(nèi)殺傷性T細(xì)胞的數(shù)量，識別腫瘤細(xì)胞起到有效殺滅腫瘤細(xì)胞的目的。聯(lián)合靜脈輸注+局部注射CAR-T細(xì)胞治療復(fù)發(fā)性彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）結(jié)外病變，患者獲得持久緩解，無嚴(yán)重不良反應(yīng)，靜脈輸液+局部注射可能成為部分患者更優(yōu)回輸途徑。

       02

       CAR-T細(xì)胞復(fù)雜的制備工藝帶來高昂成本

       CAR-T細(xì)胞規(guī)模生產(chǎn)中的影響因素

       根據(jù)已披露的臨床試驗(yàn)，CAR-T療法從白細(xì)胞采集到回輸?shù)臅r(shí)間大多在10-25天左右，獲取并激活T細(xì)胞耗時(shí)1天，載體轉(zhuǎn)染耗時(shí)2天，擴(kuò)大培養(yǎng)耗時(shí)7天左右，制備及質(zhì)控耗時(shí)3天左右。其中Kymriah制備耗時(shí)為22天，Yescarta為17天。雖然目前的細(xì)胞療法開發(fā)過程中基本方案類似，但是工業(yè)界還沒有開發(fā)出一個(gè)成熟的，完全可被接受的CAR-T生產(chǎn)工藝，許多CAR-T產(chǎn)品使用人工操作，非常耗時(shí)耗力，而且難以擴(kuò)大，失敗率高。整個(gè)CAR-T制備工藝非常復(fù)雜，而相對應(yīng)的其生產(chǎn)工藝過程的優(yōu)化卻較為緩慢。

       如前所述，相當(dāng)大的可變因素可能會阻礙CAR-T細(xì)胞的制造，CAR-T細(xì)胞制造中變異的主要來源——

       （A）操作變異(方法、人員、設(shè)備)：這主要是操作員/操作設(shè)備變化的結(jié)果，特別是在使用手動式處理系統(tǒng)時(shí)，完全自動化的制造程序可以將操作變異帶來的影響降至最低；

       （B）原材料和試劑（血清、培養(yǎng)基、生長因子等）：用于更好實(shí)現(xiàn)細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)基和試劑（例如細(xì)胞生長因子）目前尚未標(biāo)準(zhǔn)化，原材料和試劑如果根據(jù)GMP規(guī)范制造可能難以獲得；

       （C）環(huán)境變量（溫度、粒子數(shù)、氣體張力、濕度）：在CAR-T細(xì)胞制造過程中應(yīng)監(jiān)測環(huán)境參數(shù)以確保制造過程一致性，確保產(chǎn)品質(zhì)量和無菌性，在理論上這些方面可以通過功能封閉的系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)；

       （D）生物因素（起始材料質(zhì)量和組成）：這是最重要的因素。生物因素是CAR-T細(xì)胞制造中不可避免的變量 ，其中最重要的可變性包括：細(xì)胞活力、T細(xì)胞含量、健康狀況和表型。

       另外不同患者的輔助細(xì)胞也會有很大的差異，例如巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞。但是細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)量控制的安全性、純度、效力以及均一性會貫穿CAR-T生產(chǎn)的各個(gè)階段，這也增加了CAR-T治療的成本。

       圖5 CAR-T細(xì)胞規(guī)模生產(chǎn)中的變量

       CAR-T細(xì)胞制備的成本構(gòu)成，耗材占用總成本的一半

       Kymriah在美國定價(jià)為47.5萬美元/針，Yescarta在美國定價(jià)為37.3萬美元/針，在中國上市的奕凱達(dá)和倍諾達(dá)的價(jià)格為120萬元/針和129萬元/針。CAR-T價(jià)格高昂主要是由針對患者的個(gè)性化定制帶來的極高生產(chǎn)成本導(dǎo)致。

       根據(jù)發(fā)表在《international journal of cancer》的文獻(xiàn)報(bào)道，生產(chǎn)單人份CAR-T細(xì)胞成本約為8萬美元。在CAR-T的整個(gè)生產(chǎn)流程中，占用成本最多的是培養(yǎng)及轉(zhuǎn)導(dǎo)CAR-T所用的培養(yǎng)液、質(zhì)粒、核酶、病毒載體等耗材，占用了成本的約49~51%，具體金額在5萬美元/針左右。CAR-T的生產(chǎn)與化學(xué)成分生產(chǎn)與控制（CMC）水平相關(guān)，以激活所使用的CD3/CD28beads為例，一管約在8萬元，制備一份CAR-T細(xì)胞需使用1/4~1/3，若CMC要求高，則剩余的beads都不能再使用，這也將造成成本的增加。所用病毒載體的GMP生產(chǎn)約占總成本的30%，當(dāng)對病毒載體的需求量增大時(shí)，可降低CAR-T細(xì)胞制備的生產(chǎn)成本，以葛蘭素史克的慢病毒載體生產(chǎn)為例，生產(chǎn)100劑CAR-T慢病毒載體時(shí)，成本約為2.5萬美元/劑，生產(chǎn)1000劑時(shí)，成本約為4000美元/劑；生產(chǎn)10000劑時(shí)，成本約為1500美元/劑。其次是質(zhì)控過程測量CAR-T產(chǎn)品無菌水平、細(xì)胞存活、CAR表達(dá)水平等所需的耗材，占用總成本的24~25%，具體金額約為2.5萬美元/針。目前影響CAR-T生產(chǎn)成本最大的兩項(xiàng)因素是產(chǎn)能利用率和病毒載體，提升生產(chǎn)規(guī)模和降低基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的成本是降低CAR-T成本最有效的方式。

       圖6 CAR-T生產(chǎn)成本分析（Kymriah為例）

       總之：CAR-T治療復(fù)雜的工藝以及針對患者的個(gè)性化定制是導(dǎo)致成本高昂的主要原因，限制了產(chǎn)品臨床試驗(yàn)的推進(jìn)和可及性。但是CAR-T細(xì)胞療法治療在臨床應(yīng)用的開展至今不過短短十幾年時(shí)間，隨著CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)的逐步改進(jìn)和完善，開發(fā)同種異體CAR-T已經(jīng)成為該療法下一步的發(fā)展方向。通用型CAR-T(UCAR-T)可實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)流程的規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化，可將生產(chǎn)成本降低90%，也期待著CAR-T治療成本降低來惠及更多患者。