轉錄因子介紹

       轉錄因子通過與特定DNA 結合序列結合來幫助打開或關閉基因，調控了幾乎整個基因組。所有轉錄因子 (TF) 都包含兩個通用蛋白質結構域：一個與特定 DNA序列結合的 DNA 結合域 (DBD)，一個招募共激活因子的效應域。許多轉錄因子還包含一個或多個調節(jié)結構域，這些結構域通常用于調節(jié)轉錄因子定位和功能，例如STAT3，通過其SH2結構域來實現(xiàn)二聚化并調控靶基因的表達。

       據(jù)估計，人類基因組中至少有 1,600 個 TF，其中約 19% 與疾病表型相關。如 p53、Myc、雄激素受體 (AR)、雌激素受體 (ER) 、缺氧誘導因子 (HIF)、NF-κB等轉錄因子，它們參與各種促癌事件，p53 是研究最多的腫瘤抑制因子，在超過 50% 的人類癌癥中發(fā)生功能獲得性突變失活或變成致癌物。核受體 AR 和 ER 分別與內分泌驅動的前列腺癌和女性癌癥（如乳腺癌、卵巢癌和子宮內膜癌）的發(fā)病機制密切相關。HIF-1在大多數(shù)實體瘤中過度表達。NF-κB是經典激活巨噬細胞的關鍵轉錄因子，可介導產生大量炎癥因子。

       轉錄因子在選擇性基因調控中起基礎作用，因此比激酶等上游信號蛋白具有更高特異性的疾病調節(jié)能力，并且由于基因靶標受DNA 結合特異性控制，所以單個 TF 通常只調節(jié)有限的一組基因靶標，因此這種抑制劑也不容易其他藥物常見的補償性耐藥機制。所以靶向異常的轉錄因子是一種有效治療疾病的策略。

       但由于轉錄因子的結構異質性，并缺乏活性位點，傳統(tǒng)上認為其難以成藥。研究表明轉錄因子存在高度動態(tài)的蛋白質-DNA 和蛋白質-蛋白質相互作用，蛋白質-DNA 相互作用界面通常是凸面且?guī)д姾桑鞍踪|-蛋白質相互作用界面通常更平坦且缺乏結合袋，小分子很難直接靶向。

       靶向轉錄因子的小分子抑制劑

       其中，核受體 (NRs)和bHLH-PAS家族是類特殊的 TF 家族，其具有一個 DNA 結合域 (DBD) 和一個配體結合域 (LBD)，bHLH-PAS家族是通過與其家族成員二聚化形成LBD。當與小分子配體結合時，會誘導 NRs 構象變化，調節(jié)它們與各種轉錄輔助調節(jié)因子（如共激活因子或輔助抑制因子）的相互作用，從而控制下游靶基因的表達，目前開發(fā)的小分子抑制劑主要靶向這兩類TFs。

       核受體包括雄激素AR、雌激素ER等。AR與 AR LBD 的結合導致細胞核易位并啟動靶基因表達，這是前列腺癌的關鍵驅動因素，因此 AR 是一種重要的治療靶點。AR拮抗劑與LBD結合會阻斷AR信號通路，恩雜魯胺、阿帕魯胺和darolutamide是第二代AR拮抗劑，最近已被FDA批準用于治療人類前列腺癌，與第一代相比療效更強，副作用減少。此外，一些AR拮抗劑正在進行臨床試驗，如proxalutamide和EPI-7386。為避免不良副作用（如AR信號通路對肌肉和骨骼的合成發(fā)揮代謝作用），在過去的二十年中合成和開發(fā)了選擇性AR調節(jié)劑（SARMs），如GTx-024，AR或 SARM 與 AR LBD 結合并誘導構象變化，從而促進募集共激活因子，并激活基因表達。

       大約 75% 的乳腺癌都是 ER 陽性的， ER 信號傳導是乳腺癌的關鍵驅動因素。選擇性ER調節(jié)劑SERM（如他莫昔芬）與 LBD 結合，阻斷募集共激活因子所需的構象變化，從而降低靶基因表達。

       盡管AR或ER的抑制劑或選擇性調節(jié)劑能降低靶基因表達，但內在和獲得性抗性的出現(xiàn)限制其應用。以事件驅動的方式誘導靶蛋白質降解的 PROTAC 技術在克服這個問題方面顯示出巨大前景，將在下文介紹。

       最后，盡管 NR 由于LBD的存在最易成藥，但靶向 NR所有家族成員仍然是一項非常具有挑戰(zhàn)性的任務。例如那些被稱為孤兒受體的 NR，其沒有指定的內源性配體或明顯的配體結合口袋。此外在某些疾病中， NR 剪接變體的出現(xiàn)會使傳統(tǒng)藥物失效，例如 AR-V7，為 AR 的剪接變體。傳統(tǒng)的 NR 靶向藥物都是與其 LBD 口袋結合。最近，NR 共激活因子結合抑制劑也被開發(fā)用于調節(jié) NR 活性。

       蛋白質-蛋白質相互作用 (PPI) 在許多生理過程中發(fā)揮重要作用，并且在疾病中經常失調。因此，PPI 也被認為是潛在的治療靶點。例如p53-MDM2抑制劑和menin-MLL抑制劑。在癌癥中，TF p53（“基因組的守護者”）和泛素 E3 連接酶 MDM2 之間的 PPI 通常作為癌細胞通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)下調 p53 水平來逃避凋亡的機制。然而p53 是一種高度無序的 TF，因此開發(fā)一種與 p53 結合并使其免受蛋白酶體降解制的小分子極具挑戰(zhàn)性。幸運的是MDM2 的 p53 結合位點是一個相對較小且定義明確的疏水口袋，因此可以設計抑制它們相互作用的小分子藥物，如HDM201 和 RG7388來抑制p53的泛素化。

       共激活因子menin與MLL融合蛋白的相互作用對于 MLL 融合陽性白血病是必不可少的，因此開發(fā)小分子抑制劑對治療白血病有效，例如已經開發(fā)的MI-538 和 MI-1481，通過阻斷其相互作用而抑制白血病。

       但蛋白質-蛋白質界面通常是疏水性的，難以開發(fā)具有理想成藥性質的小分子化合物。與酶的活性位點或受體的結合位點相比，蛋白質-蛋白質相互作用界面更加平坦穩(wěn)定，難以靶向。此外，蛋白質-蛋白質界面相對沒有特征，缺乏可以完全容納小分子配體的疏水腔。因此蛋白質-蛋白質相互作用抑制劑的未來發(fā)展方向應該是優(yōu)先設計新的化學、生物和計算工具，并且擴大化學庫以篩選有效小分子。

       靶向轉錄因子的PROTAC降解劑

       在細胞中，必須破壞不必要或錯誤折疊的蛋白質以確保細胞蛋白質穩(wěn)態(tài)，這個過程受到細胞內泛素蛋白酶體機制的嚴格控制。通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)劫持內源性 E3 連接酶降解感興趣的蛋白質 (POI)，開發(fā)了靶向蛋白水解的嵌合體 (PROTAC)。PROTAC 是一種異雙功能分子，含有一個與 POI 結合的配體和一個 E3 泛素連接酶的共價連接配體，通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)導致蛋白質靶標的降解。

       與傳統(tǒng) SMI 的占用驅動操作模式不同，PROTAC 以事件驅動的方式降解POI，無需分離配體來識別靶向 POI ，提供了一種新的策略來抑制以前無法成藥的靶標，且具有較強的靶標選擇性，并有可能克服傳統(tǒng) SMI 常見的耐藥性。ROTACs 能消除靶蛋白的所有功能，而不僅僅是特定小分子抑制劑所靶向的活性。并且這種方法也是催化的，允許單個分子通過重復的結合和降解循環(huán)介導多個靶蛋白的破壞，可以減少給藥頻率。但也有一些局限性，如不良的藥代動力學特征、嚴重依賴E3泛素連接酶和存在潛在脫靶毒 性。

       目前靶向AR的PROTAC研究很多。2008 年，Crews 實驗室報告了第一個 PROTAC AR 降解劑，該降解劑使用 MDM2 抑制劑作為 E3 連接酶配體,比卡魯胺作為 AR 拮抗劑。雖然化合物131僅在微摩爾濃度下降解細胞中的 AR 蛋白，但它提供了重要的概念驗證。

       化合物135-137用高效的AR拮抗劑和VHL配體設計PROTAC，盡管都具有出色的降解能力，但在動物體內的口服生物利用度較低，這限制了其進一步發(fā)展。ARD69 和 ARD266 表明，具有高剛性接頭的 PROTAC 能提高活性。

       由高效的 AR 配體和帶有剛性接頭的 CRBN 配體設計的 AR PROTAC 已顯示出優(yōu)異的 AR 降解效力、有效的細胞生長抑制活性、良好的 PK 曲線以及有效的抗腫瘤功效。目前ARV-110已進入臨床二期，它由強效抑制劑，CRBN配體通過剛性連接子相連，具有非常出色的AR降解效力、在野生型和具有 AR T878A 和 H875Y 突變體的前列腺癌患者中效果明顯。Avinas 還有一款口服PROTAC 藥物ARV-766正在進行臨床一期試驗。

       盡管目前已研發(fā)出大量的激動劑和拮抗劑，但報道的 AR PROTAC 僅使用少數(shù) AR 抑制劑及其衍生物，包括比卡魯胺、恩雜魯胺和化合物72來自輝瑞，且只有 CRBN 配體才能提供良好的口服生物利用度。

       信號轉導和轉錄激活因子 3 (STAT3) 是 STAT 家族的成員，可響應各種細胞因子、生長因子和癌基因信號而被激活，其激活通常與預后不良有關。STAT3通過一個Tyr705位點磷酸化的單體與另一個單體的SH2結合域的結合口袋相互作用進行二聚化，隨后激活靶基因。因此STAT3 SH2 結構域的抑制劑能抑制STAT3活性。但 STAT3 和其他 STAT 家族成員共享一個高度結構同源的 SH2 結構域，難以獲得高度選擇性的 STAT3 抑制劑。并且單體 STAT3 蛋白也具有轉錄活性，因此阻斷 STAT3 二聚化的 STAT3 SH2 結構域抑制劑僅部分抑制 STAT3 的基因轉錄活性。研究人員通過優(yōu)化以前的 STAT3 SH2 結構域抑制劑 CJ-887，開發(fā)了一種可滲透細胞的 高效STAT3 降解劑SD-36。

       Forkhead box M1 (FOXM1)，是一種對細胞分裂至關重要的轉錄因子，F(xiàn)OXM1 轉錄活性增加與癌癥患者的不良預后有關。對FOXM1 的 DNA 結合域進行計算機建模，確定了一種合適的抑制 FOXM1-DNA 相互作用的小分子，并設計了一種基于 CRBN 的 PROTAC，可顯著降解 FOXM1 蛋白并具有抗腫瘤活性。

       與經典的轉錄活性抑制劑相比，這些基于小分子的 PROTAC 具有改善的口服生物利用度、低毒 性和卓越療效等優(yōu)點，目前這些針對轉錄因子的PROTACs正處于I期和II期臨床試驗中。

       如上所述，SMI 可以靶向 AR、ER 和 STAT3 等一些轉錄因子，從而可以基于這些 SMI 設計開發(fā) PROTAC。然而，大多數(shù)轉錄因子仍然無法成藥或難以成藥。轉錄因子以序列特異性方式識別啟動子和增強子 DNA 中的順式調節(jié)元件，但這些關鍵功能位點也難以設計SMI。利用轉錄因子具有特定 DNA 結合序列這一特點，目前幾項研究已使用這些寡核苷酸序列作為配體，開發(fā) PROTACs 用于靶向降解轉錄因子。

       Crews開發(fā)了一種 TRAFTAC（靶向轉錄因子的嵌合體），它使用異雙功能雙鏈 DNA/CRISPR-RNA 嵌合體同時結合感興趣的轉錄因子 (TOI) 和 dCas9-HaloTag7 融合蛋白 (dCas9-HT7，用作中間蛋白) 。CRISPR-RNA 與異位表達的 dCas9-HT7 結合，后者又在 haloPROTAC 存在下招募 VHL E3 連接酶復合物。然后嵌合體的雙鏈 DNA 部分識別 TOI 并使 TOI 和 E3 復合物接近誘導TOI 降解。作為概念驗證，他們首先選擇了典型的癌基因 NF-κB 作為靶點。NF-κB-TRAFTAC 與 dCas9-HT7 融合蛋白和 NF-κB 亞基 p50 結合，在 haloPROTAC 處理后誘導 p50 顯著降解。

       為了開發(fā)一種更直接的方法來降解轉錄因子，研究人員通過點擊反應將 DNA 寡核苷酸鏈與 E3 連接酶配體連接，以選擇性降解TOI，稱為 TF-PROTAC。

       通過無金屬銅響應的疊氮化物-炔烴環(huán)加成 (SPAAC) 反應將市售的疊氮化物修飾的 DNA 寡聚物 (N3-ODN) 與具有各種接頭 (VHLL-X-BCN) 的雙環(huán)辛炔 (BCN) 修飾的 VHL 配體結合。在去除多余配體 VHLL-X-BCN 的簡單純化過程后，TF-PROTAC 已準備好轉染到細胞中，通過 DNA 寡核苷酸鏈的選擇性識別并結合特定TF，使其降解。

       目前開發(fā)了兩個基于 VHL 的 TF-PROTAC，NF-κB-PROTAC (dNF-κB) 和 E2F-PROTAC (dE2F)，分別有效降解細胞中的內源性 p65 和 E2F1 蛋白，并在細胞中顯示出優(yōu)異的抗增殖活性。總的來說， TF-PROTACs 提供了一個可通用的平臺來實現(xiàn) TFs 的選擇性降解，但因為缺少體內數(shù)據(jù)，其臨床應用仍有待確定。

       總結

       盡管基于小分子的 PROTAC 在臨床上已顯示巨大的前景，但尋找合適的配體來選擇性地靶向轉錄因子依然挑戰(zhàn)重重。由于寡核苷酸 DNA 是轉錄因子的天然配體，基于寡核苷酸的 PROTAC 具有普遍性和靈活性，并且可以通過替換嵌合寡核苷酸的 DNA 序列來靶向其他轉錄因子，從而為靶向傳統(tǒng)上不可成藥的轉錄因子鋪平道路。此外，鑒于寡核苷酸具有穩(wěn)定性、組織滲透性，免疫原性和低毒 性等特點，基于寡核苷酸的 PROTAC 平臺為臨床開發(fā)治療性PROTAC提供廣泛前景。

       盡管如此，它們的臨床前和臨床開發(fā)也存在眾多挑戰(zhàn)，如寡核苷酸的 PROTAC 總是帶有大量負電荷，并且其次優(yōu)的藥代動力學和相對較低的藥效可能會限制其未來發(fā)展。

       作為該技術的未來拓展，RNA結合蛋白可以通過RNA識別序列形成RNA-蛋白相互作用參與多種生物學過程，包括RNA轉錄和mRNA翻譯，鑒于轉錄因子和 RNA 結合蛋白之間的相似性，基于寡核苷酸的 PROTAC 為此類蛋白質的靶向降解提供思路。隨著技術的成熟，確定基于 DNA 和 RNA 的 PROTAC 的臨床應用前景值得期待。

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