在抗體和蛋白類藥物研究開發(fā)中，防止蛋白聚集一直是研發(fā)人員面臨的主要挑戰(zhàn)之一，這些聚集物不僅會影響藥物的質(zhì)量和療效，還可能在體內(nèi)引發(fā)免疫原性反應(yīng)，導致安全性問題。

       大量研究表明，包材和給藥裝置常用的硅油和制劑處方中常用的吐溫降解產(chǎn)物，是抗體或蛋白溶液系統(tǒng)中潛在的不穩(wěn)定因子，本文結(jié)合相關(guān)研究文獻以及東曜藥業(yè)眾多項目的處方開發(fā)、包材篩選的實戰(zhàn)經(jīng)驗，對硅油、吐溫和蛋白間的關(guān)系進行簡要論述。

       西林瓶或預(yù)充注射器中的膠塞通常需要使用適量硅油硅化處理，以提高其潤滑性，減少膠塞因摩擦產(chǎn)生的微粒污染。而膠塞上的硅油可能在處理、使用甚至儲存過程中發(fā)生脫落，與水形成硅油-水界面，暴露出其疏水表面，從而會吸附藥物，吸附的蛋白部分去折疊暴露疏水基團，在硅油-水界面形成蛋白膜，誘導蛋白聚集，同時形成的硅-蛋白顆粒也會導致微粒增加，因此液體制劑長期儲存過程中的蛋白聚集增加及微粒增加，其包材硅油脫落可能是導致此現(xiàn)象出現(xiàn)的原因之一。許多文獻研究了在加速條件下抗體和硅油的相容性，并對粒子進行表征，發(fā)現(xiàn)高溫、剪切力和膠塞的硅化處理方式等因素均會誘導蛋白在硅油滴上沉淀，產(chǎn)生硅-蛋白微粒。

       Jones等人研究發(fā)現(xiàn)在蛋白溶液中添加0.5%的硅油，置于45℃試驗5h后，會對四種不同分子量和等電點的蛋白質(zhì)產(chǎn)生明顯誘導聚集，其中血清白蛋白(BSA)有更大的聚集傾向，推測是由于其在四個分子中疏水性最強[1] 。

       Amgen公司通過在IgG1抗體溶液中加入1.5%的硅油后進行研究[2]，發(fā)現(xiàn)該濃度硅油會在溶液中形成每毫升含量約2×109~2.3×109個平均直徑約為5μm的硅油液滴，而抗體則會吸附在液滴上大致形成一層蛋白膜，研究人員也通過0.02μm針頭濾膜過濾對吸附在硅油液滴上的抗體進行了量化，下方Table 1為未添加硅油制劑過濾前后蛋白濃度差，Table 2則為添加硅油后過濾前后蛋白濃度差，二者濃度差的差值（見標記處）為吸附在硅油液滴上的蛋白量，可見除添加蔗糖的制劑外，均有明顯的蛋白吸附至硅油液滴上。

       該研究發(fā)現(xiàn)，相對于靜置，添加硅油的制劑攪拌后更容易導致蛋白的聚集，且轉(zhuǎn)速越高蛋白聚集越快(Figure 1)。其中，未攪拌及攪拌轉(zhuǎn)速低于200 rpm的樣品在相同條件下聚體未增加。推測是由于攪拌破壞了蛋白在硅油上的吸附界面以及水-空氣界面，從而導致了蛋白的聚集。而振蕩攪拌在運輸及使用過程中常常會發(fā)生，因此制劑開發(fā)過程中需要關(guān)注成品在振蕩攪拌過程中的穩(wěn)定性變化情況。

       破壞蛋白溶液-硅油界面，不僅會誘導蛋白聚集，還會導致微粒的增加。MedImmune公司早期研究發(fā)現(xiàn)[3]，在試管中蛋白溶液的液面添加一層硅油，分別使用針頭旋轉(zhuǎn)攪拌(Rupture)、固定針頭旋轉(zhuǎn)不攪拌(No rupture)及無針頭旋轉(zhuǎn)(No Needle)，發(fā)現(xiàn)用針頭攪拌的樣品微粒大大增加 (Figure 2)，推測使用針頭攪拌硅油層，使蛋白持續(xù)暴露在水-氣界面，導致微粒明顯增加。

       但是，此情況在加入聚山梨酯20/80后有所好轉(zhuǎn)。研究人員在蛋白溶液中加入聚山梨酯20/80，對含有硅油層的蛋白溶液進行針頭攪拌，相對于未添加聚山梨酯20/80的溶液，微粒明顯降低 (Figure 3)， 該研究也表明，加入聚山梨酯后，蛋白聚集也有所抑制。

       因此，處方中添加聚山梨酯20/80，以及部分研究表明添加泊洛沙姆188，添加此類非離子型表面活性劑，對于吸附在硅油-水界面的蛋白，能夠在一定程度上起到降低微粒的增加及蛋白聚集的作用，前兩者均于上市抗體藥物中廣泛使用。研究亦表明，在0.001%的濃度下，PS80相比PS20更能抑制蛋白吸附在硅油-水界面，但是提高表面活性劑濃度后，二者則作用相當。

       Kannan等人[4]研究了表面活性劑泊洛沙姆188和PS20通過競爭性吸附在油水界面降低抗體聚集的作用。其中PS20具有更強的表面活性，競爭性吸附作用更強，但是，較低的界面張力和更強的液滴穩(wěn)定性導致含有PS20的攪拌混合物中存在更多的硅油液滴，增加了單抗吸附的界面面積與聚體的形成。

       Alana Gerhardt等[5]進一步研究認為，當表面活性劑濃度高于臨界膠束濃度(CMC)時，PS20通過優(yōu)先吸附在硅油-水界面上，減少界面誘導的蛋白質(zhì)聚集；當表面活性劑濃度低于CMC時，PS20與蛋白質(zhì)的疏水基團相互作用，形成表面活性劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物，抑制了界面凝膠形成所必需的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，抑制硅油-水界面的吸附蛋白層凝膠化，從而減少顆粒生成。然而，聚山梨酯并非萬金油的存在，其本身降解對抗體穩(wěn)定性所產(chǎn)生的影響也越來越受到各界的關(guān)注。

       聚山梨酯是由聚氧乙烯山梨醇的脂肪酸酯組成的兩親性非離子表面活性劑，月桂酸和油酸分別是聚山梨酯20 NF(National Formulary)和聚山梨酯80 NF中的主要脂肪酸成分。近年來有越來越多的報告稱吐溫降解可能破壞蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性，導致溶液中的亞可見顆粒數(shù)增多，蛋白質(zhì)聚集或氧化。

       吐溫的降解方式主要有自氧化、環(huán)氧乙烷亞基裂解和脂肪酸酯酶水解。環(huán)氧乙烷的自氧化會導致過氧化氫的形成，側(cè)鏈裂解，最終形成短鏈酸，如甲酸。吐溫氧化形成的過氧化氫已知會引起蛋白質(zhì)的氧化, 如重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(rhCNTF)和重組人神經(jīng)生長因子(rhNGF)這兩種治療蛋白, 通過添加抗氧化劑如半胱氨酸，硫代甘油和甲硫氨酸來防止氧化。

       脂肪酸酯鍵裂解（聚山梨酯20為亞油酸、聚山梨酯80為油酸）反應(yīng)取決于溶液的pH值、氧、過氧化物、熱、紫外線和金屬離子（如銅）等因素，在室溫（25℃）下存儲聚山梨酯主要導致脂肪酸酯水解，而在更高的溫度下存儲也會導致環(huán)氧乙烷亞基的自氧化[6]。

       在生物制劑的純化步驟中，自細胞碎片中分離單克隆抗體(mAbs)時，經(jīng)常會有極微量乃至低于檢測限而幾乎無法檢測到的宿主細胞蛋白(HCPs)殘留在最終藥品(DP)中。具有酯酶活性的HCPs可催化聚山梨酯的水解反應(yīng)，導致不溶性游離脂肪酸(FFA)釋放到溶液中。這些脂肪酸可以形成大量可見和亞可見的微粒[7]。

       而如何避免聚山梨酯的降解，除了控制制劑最終藥品中HCPs、金屬離子類雜質(zhì)外，對聚山梨酯的采購和使用也有一定的要求。除采購純度較高的聚山梨酯外，使用過程中，對于大包裝的聚山梨酯，如開封后短期無法全部用完，建議分裝為小包裝，充氮、避光、低溫條件下儲存，能夠降低其氧化降解的速率，也可以通過添加低濃度的抗氧化劑丁基羥基甲苯（BHT）來防止降解。

       參考文獻

       [1] JONES et al., Silicone Oil Induced Aggregation of Proteins. Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol.94:918-927, 2005

       [2] THIRUMANGALATHU et al.,Silicone Oil- and Agitation-Induced Aggregation of a Monoclonal Antibody in Aqueous Solution. JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, VOL. 98, 3: 167-3181, 2009.

       [3] Mehta et al., Gelation of a Monoclonal Antibody at the Silicone Oil-Water Interface and Subsequent Rupture of the Interfacial Gel Results in Aggregation and Particle Formation. JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES 104:1282-1290, 2015.

       [4] Kanan et al., Adsorption and Aggregation of Monoclonal Antibodies at Silicone Oil-Water Interfaces. Mol. Pharmaceutics 2021, 18, 1656?1665, 2021.

       [5] Gerhardt et al., Surfactant Effects on Particle Generation in Antibody Formulations in Pre-filled Syringes. Journal of Pharmaceutical Sciences, 104(12), 4056-4064. 2015.

       [6] Bruce A Kerwen, Polysorbates 20 and 80 Used in the Formulation of Protein Biotherapeutics: Structure and Degradation Pathways. J Pharm Sci. 97(8):2924-35. 2008.

       [7] Roy et al., Polysorbate Degradation and Particle Formation in a High Concentration mAb: Formulation Strategies to Minimize Effect of Enzymatic Polysorbate Degradation. J Pharm Sci. 110(9):3313-3323. 2021.