1

       β-catenin、BCL9通路

       與蛋白結構

       自1982年發(fā)現(xiàn)第一個WNT1（最初命名為Int-1）基因以來，Wnt信號通路一直是開發(fā)新癌癥療法中一個令人興奮的話題。目前，Wnt信號通路分為經(jīng)典Wnt（Wnt/β-catenin）信號通路和兩個非經(jīng)典Wnt（Wnt/Ca2+和Wnt/PCP）信號通路。

       研究最多的途徑是經(jīng)典Wnt信號通路（通過β-Catenin激活基因轉(zhuǎn)錄），其協(xié)調(diào)健康胚胎中的組織更新和干細胞增殖、遷移、分化、存活發(fā)育和成人組織穩(wěn)態(tài)。Wnt/β-catenin信號傳導的異常激活與許多人類疾病密切相關，因為它參與止血功能。

       β-catenin充當細胞質(zhì)中的分子效應子。然而，當定位到質(zhì)膜時，β-catenin則充當E-鈣粘蛋白和細胞骨架相關肌動蛋白之間的橋梁，在細胞之間形成貼壁連接。

       在沒有細胞外Wnt配體的情況下（圖1A），β-catenin破壞了由軸抑制蛋白（Axin），腫瘤抑制性腺瘤性大腸息肉?。ˋPC），酪蛋白激酶1α（CK1α），糖原合酶激酶-3β（GSK-3β），E3泛素連接酶β-TrCP和凌亂蛋白（DVL）形成的復合物。在該復合物中，β-catenin的N端結構域S33，S45，S37和T41被CK1α和GSK-3β磷酸化。磷酸化后的β-catenin被β-TrCP泛素化，從而促進了β-catenin的蛋白酶體降解[1]。

       相反，在生理條件下（圖1B），細胞外Wnt配體與DVL和低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6（LRP5/6）結合，激活DVL導致LRP6的磷酸化和Axin1的募集，從而抑制β-catenin的磷酸化和隨后的蛋白酶體降解。

       β-catenin在細胞質(zhì)中積聚并易位到細胞核以結合T細胞因子（TCF）或淋巴增強子結合因子（LEF）和幾種輔助因子，包括B細胞淋巴瘤 9 （BCL9）；cAMP反應元件結合蛋白（CREB）結合蛋白（CBP）；E1A 結合蛋白300 Da （p300） 和 Pygopus（Pygo 1或2），激活 Wnt 靶標基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移、存活、化療耐藥性和腫瘤免疫逃避。

       圖1. Wnt/β-catenin信號傳導的機制

       在哺乳動物細胞中，Wnt/β-catenin通路通過一系列胞質(zhì)蛋白相互作用，使 β-catenin 蛋白在胞質(zhì)內(nèi)累積，進而入核傳遞生長刺激信號。該信號通路一旦出現(xiàn)異常就可能使細胞及生物體的功能產(chǎn)生一定程度的障礙或損壞，進而導致機體腫瘤的發(fā)生。目前，Wnt/β-catenin 通路已成為藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的主要靶標之一。

       人的β-catenin蛋白由781個氨基酸組成，包括N末端結構域，C末端結構域和包含12個armadillo重復序列（殘基141?664）的中央armadillo重復結構域（ARD）。ARD 的N和C端結構域在很大程度上是非結構化的，并不像armadillo重復結構域的那樣保守（圖2）。

       圖2. β-catenin的結構

       據(jù)報道，大于20種β-catenin結合蛋白可以與β-catenin的armadillo重復結構域（ARD）結合形成相互作用，并且已經(jīng)解析出β-catenin與一些結合蛋白（如人APC蛋白，人Axin蛋白，小鼠LEF1蛋白，非洲爪蟾TCF3蛋白，人ICAT蛋白，人TCF4蛋白，人BCL9蛋白以及Wnt信號相關蛋白鼠E-鈣粘蛋白和人LHR1蛋白）的晶體復合物結構（圖3）。

       圖3. β-catenin及其相互作用伙伴

       值得注意的是，通過β-catenin及其核伙伴蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）轉(zhuǎn)錄激活靶基因，包括β-catenin/TCF、β-catenin/BCL9、β-catenin/CBP和β-catenin/p300，是Wnt/β-catenin信號傳導的最后一步途徑，表明破壞這些核復合物可能成為阻斷Wnt/β-catenin信號異常激活的最有希望的策略。本文主要介紹破環(huán)β-catenin與BCL9蛋白蛋白相互作用的小分子抑制劑。

       人的BCL9蛋白由1394個氨基酸組成，可作為Wnt/β-catenin途徑的轉(zhuǎn)錄共激活劑。它有三個保守區(qū)域：Pygopus結合域HD1，β-catenin結合域HD2和典型的核定位信號肽HD3。

       β-catenin/BCL9復合物在腫瘤組織中占主導地位，但在健康細胞中不占主導地位。此外，抑制BCL9可以減少腫瘤生長，促進CD8+ T細胞腫瘤浸潤，增強小鼠CRC模型中對抗PD-1治療的反應。

       β-catenin/BCL9蛋白蛋白相互作用（PPI）接口掩埋了大約 1450 ?2，中等強度的 Kd約0.50 μM。β-catenin/BCL9 PPI 為由大約25個殘基螺旋段介導來自 BCL9的兩個熱點（圖 4）。熱點區(qū)域1包括β-catenin的D162、E163 和D164以及BCL9的H358和R359；熱點區(qū)域2包括β-catenin的A149、A152、L156、L159、L160、V167、A171、M174 和 L178和BCL9的L366、I369 和 L373。

       圖4. β-catenin /BCL9復合物的兩個主要熱點區(qū)域（PDB：2GL7）

       2

       β-catenin、BCL9的蛋白

       與蛋白相互作用小分子抑制劑

       β-catenin和核伙伴PPI的界面通常較大（約1450?3700 ?2）且平坦（通常暴露于溶劑），并且具有緊密的結合親和力（如β-catenin/TCF，具有Ki為7?10 nM），主要由疏水和帶電特性主導，這使得使用單個低分子量抑制劑難以阻斷 PPI。

       β-catenin/BCL9 PPI 界面要小得多（1450 ?2），并且該 PPI 顯示0.5 μM 的中等KD。β-catenin與BCL9相互作用的表面與其他β-catenin結合蛋白相互作用的表面幾乎沒有重疊，而E-鈣粘蛋白（區(qū)域V）是唯一已知的結合這種PPI的蛋白質(zhì)接口。

       盡管開發(fā)β-catenin與BCL9的蛋白與蛋白相互作用抑制劑有挑戰(zhàn)，但是目前也有一些破壞它們相互作用的抑制劑被報道。

       2012年，Bienz等人通過ELISA篩選47,500種LOPAC/PhytoPure/MRCT化合物，發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物carnosic acid（1）為一種新型β-catenin/BCL9抑制劑。Carnosic acid特異性結合HD2-ARD，它的Ki為3.3 μM。核磁共振和晶體學分析揭示了carnosic acid在前四個ARD處直接結合β-catenin；與BCL9結合位點相鄰的固有不穩(wěn)定α螺旋在β-catenin是與carnosic acid相互作用所必需的（圖5）[2]。

       圖5. carnosic acid（1）的結構與結合活性

       Ji等人使用ALPHAScreen選擇性測定法篩選207種天然產(chǎn)物/LOPACPfizer化合物，發(fā)現(xiàn)CP-868388（2），它的Ki為1.2 μM，并且它對β-catenin/BCL9的選擇性是 β-catenin/E-鈣粘蛋白的44倍，但不抑制反式活化在Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導（圖6）[3]

       圖6. CP-868388（2）的結構與結合活性

       Ji等人基于CP-868388進行進一步藥物化學優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)了β-catenin/ BCL9相互作用的新型小分子抑制劑CPPAA-30（4），它在AlphaScreen競爭性抑制測定中以3.6 μM的Ki破壞β-catenin/ BCL9相互作用。

       基于細胞的實驗顯示，CPPAA-30選擇性地破壞了β-catenin/BCL9 PPI，同時沒有影響β-catenin/E-鈣粘蛋白PPI、劑量依賴性抑制Wnt信號反式激活、致癌 Wnt靶基因表達下調(diào)，以及靶向選擇性地抑制攜帶異常Wnt信號的癌細胞的生長（圖7）[4]。

       圖7. CPPAA-30（4）結構和活性

       Ji等人繼續(xù)優(yōu)化這類結構得到化合物ZW4864（5），在AlphaScreen測定中Ki 值為0.87 μM，與β-catenin結合并選擇性地破壞BCL9和β-catenin之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI），同時保留β-catenin/E-鈣粘蛋白PPI。ZW4864劑量依賴性抑制β-catenin信號激活，下調(diào)致癌β-catenin靶基因，并消除β-catenin依賴性癌細胞。更重要的是，ZW4864表現(xiàn)出色藥代動力學性質(zhì)并有效抑制患者來源的異種移植小鼠模型中的β-catenin靶基因表達（圖8）[5]。

       圖8. ZW4864（5）的結構和活性

       Ji等人最近也報道了基于ZW4864進行結構優(yōu)化得到化合物6，它的Ki為2.7 μM。在細胞里β-catenin /BCL9 PPI的影響通過β-catenin/BCL9下拉抑制和Wnt/β-連環(huán)蛋白信號反式激活的劑量抑制得到證實（圖9）[6]。

       圖9. 化合物6的結構以及活性

       近期，Carrasco及其同事還使用HTS鑒定了一種有效的小分子抑制劑C-1（7），該抑制劑顯著減少了CRC細胞系的增殖并抑制了CRC異種移植小鼠模型中的腫瘤生長（圖10）[7]。

       圖10. 化合物7的結構與活性

       Hoggard等人通過基于生物等排體的片段跳躍方案設計支架4'-氟-N-苯基-[1，1'-聯(lián)苯]-3-甲酰胺（化合物8），以模擬突出熱點的疏水側鏈的定位，同時考慮目標蛋白熱點口袋的大小以及新生成的配體的生物相容性結構。結合晶體結構，經(jīng)過優(yōu)化，最后得到化合物PNPB-22（9），它可以抑制Wnt通路AXIN2, LGR5, LEF1, and cyclic D的mRNA表達，可以明顯抑制一些細胞如SW480, HCT116, HT29, MDA-MB-231, MDA-MB-436等增殖（圖11）[8]。

       圖11. PNPB-22（9）的結構與活性

       Li等人發(fā)現(xiàn)一系列3-苯基哌啶衍生物抑制β-catenin/BCL9蛋白蛋白相互作用。其中，化合物10表現(xiàn)出最 好的抑制活性，在競爭性熒光偏振測定中它的IC50為0.72 μM，對β-catenin的KD值為0.26 μM。該化合物選擇性抑制CRC細胞的生長，抑制Wnt信號反式激活和下調(diào)致癌Wnt靶標基因表達（圖12）[9]。

       圖12. 化合物10的結構與活性

       Zhang等人在EJMC上報道槲皮素衍生物作為新型β-catenin/BCL9蛋白相互作用抑制劑的設計、合成和生物學評價，發(fā)現(xiàn)了化合物11，在FP assay它對β-catenin的IC50為2.78 μM，在SPR實驗中它對β-catenin的Kd為1.23 μM。它直接與β-catenin結合，并在蛋白質(zhì)水平和細胞環(huán)境中破壞β-catenin/BCL9相互作用。

       C1還有效地抑制了體外結直腸癌，并在抑制CT26和HCT116等過度活躍的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號細胞方面顯示出更好的選擇性。他們同時證實C1可以抑制CT26腫瘤在體內(nèi)的生長，調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境（圖13）[10]。

       圖13. 化合物11的結構與活性

       3

       小結

       理論上，直接破壞β-catenin與其核伙伴（包括TCF，BCL9，CBP和p300）的相互作用可以抑制過度活躍的Wnt/β-catenin信號傳導，并提供上述獨特優(yōu)勢。

       然而，最近的研究表明，幾個報道的直接靶向β-catenin的抑制劑，包括carnosic acid（1)，PNU-74654，UU-T02，PNPB-22（9）和HI?B1，在ITC和DSF測定中與β-catenin ARD沒有體外結合。這可能表明這些化合物靶向β-catenin與BCL9結合的瞬時結合位點，這也強調(diào)了直接靶向β-catenin的困難。

       總的來說，關于破壞β-catenin與其核伙伴相互作用的抑制劑開發(fā)的研究仍處于起步階段，將這里介紹的抑制劑推向臨床應用還有很長的路要走。這種批準過程緩慢的背后有四個主要因素：（1）盡管已經(jīng)廣泛研究了高度進化保守的Wnt/β-catenin信號通路40多年，但尚不清楚它是否可以成功被靶向，并具有可接受的安全性；（2）與傳統(tǒng)靶標相比設計選擇性和有效的小分子抑制劑仍然有挑戰(zhàn)。β-catenin和核伙伴PPI的界面通常較大（約1450?3700 ?2）且平坦（通常暴露于溶劑），并且具有緊密的結合親和力（β-catenin/TCF，具有Ki 為 7?10 nM），主要由疏水和帶電特性主導，這使得使用單個低分子量抑制劑難以阻斷 PPI；（3）報告的小分子β-catenin/TCF和β-catenin/BCL9抑制劑的弱結合親和力（>100 nM）和基于細胞的活性限制他們的體內(nèi)評估。β-catenin/CBP抑制劑可以與參與許多轉(zhuǎn)錄過程的一般共激活劑CBP結合，這意味著它們不太可能是Wnt途徑特異性的；（4）一些已經(jīng)描述的小分子可能直接與β-catenin結合，但目前的結果無法證實Wnt抑制從β-catenin突變或耗盡的細胞中消失。由于這些原因，β-catenin的成藥性仍有待驗證。

       許多相關的經(jīng)驗和科學的彎路指導開發(fā)β-catenin及其核伙伴PPI的抑制劑，包括以下內(nèi)容：（1）在結構優(yōu)化中應考慮PK譜，（2）這些抑制劑應在結合親和力和細胞活性保持平衡，以及（3）這些抑制劑應治療多種β-連環(huán)蛋白相關適應癥。

       破壞β-catenin與其核伙伴的相互作用具有巨大的影響挑戰(zhàn)，但該領域的研究應繼續(xù)基于目前在這些方面的成就目標，包括其高安全性和強效治療效果。隨著該領域的進展，β-catenin相互作用仍然是癌癥治療中極具吸引力的靶標。