KRAS蛋白功能及與疾病關系

       KRAS蛋白是一種小的膜結合GTP酶（GTP水解酶），可作為多種細胞信號傳導功能的開關（圖1）。核苷酸水解和交換之間的平衡決定了細胞內KRAS的水平。與鳥嘌呤核苷二磷酸（GDP）綁定，KRAS處于“關閉”狀態(tài)。在GDP與GTP交換時，通常響應生長 因子并由鳥嘌呤-核苷酸交換因子（GEF）如SOS1/SOS2促進，KRAS循環(huán)到其激活的“ON”狀態(tài)。以這種形式，KRAS激活效應途徑，包括MAPK和PI3K途徑，以促進細胞增殖和存活。

       當GTP水解為GDP時，KRAS恢復到關閉狀態(tài)，這一過程由GTP酶激活蛋白（GAP）催化。在其致癌形式中，KRAS主要保持活性ON狀態(tài)，由于其內在的GTP酶功能受損影響GTP水解[1]。

       圖1. KRAS信號通路

       KRAS的突變亞型主要分為G12C、G12D、G12V、G13D、G12R和G12A突變或KRAS野生型擴增。G12或G13的基因改變破壞精氨酸殘基水解過渡態(tài)的穩(wěn)定性。

       KRAS突變在多種癌癥中很常見，占比較多，例如美國約45%的結直腸癌（CRC）和中國約49%的結直腸癌；美國約90%的胰 腺導管腺癌（PDAC），中國約89%；美國約35%的肺腺癌（LUAD，非小細胞肺癌的一種亞型），中國約為13%（圖2）。

       KRAS突變的分布在不同的癌癥中有所不同，G12C突變出現(xiàn)在41%的LUAD中，而G12D和G12V是CRC和PDAC中最常見的兩個突變等位基因，如圖2所示。值得注意的是，其他KRAS突變如G12R僅出現(xiàn)在PDAC中。事實上，盡管腫瘤類型是由KRAS突變驅動的，但其密碼子和突變頻率因組織類型而異。

       圖2. 多種人類癌癥中KRAS突變的類型和比例

       因為KRAS突變在很多疾病中都有出現(xiàn)，市場價值巨大，所以科研機構及藥企過去幾十年對于KRAS抑制劑的開發(fā)前仆后繼，圖3可見從1994年以來臨床上對于KRAS開發(fā)進行的試驗。

       圖3. 臨床上KRAS抑制劑開發(fā)的試驗數(shù)量

       在過去40年里，KRAS由于結構特點和與GTP或GDP的結合非常強等原因被認為不可成藥。直到2021年5月28日，第一個針對KRAS G12C的抑制劑Lumakras（Sotorasib，AM510）被美國FDA已加速批準上市，打破了KRAS突變無靶向藥的僵局！

       圖4. Sotorasib知識圖譜，來源：藥渡數(shù)據(jù)

       但是Sotorasib的關鍵次要終點總生存期卻沒有實現(xiàn)顯著差異：10.6個月和11.3個月（HR，1.01 [95% CI：0.77, 1.33]；P=0.53）。而且KRAS不僅有G12C突變，也有G12D、G12V突變等，臨床需求遠遠沒有被滿足，市場前景和價值巨大。

       所以，目前針對KRAS突變選擇性抑制劑和泛抑制劑的研究很多，除了安進的Lumakras（Sotorasib，AM510）被批準之外，Mirati Therapeutics公司開發(fā)的KRAZATI（Adagrasib，MRTX849）是第二款被FDA批準上市的KRAS G12C抑制劑，它于2022年12月12日被美國FDA批準用于治療轉移性非小細胞肺癌患者。除此之外，據(jù)不完全統(tǒng)計，目前進入臨床三期的有兩款，臨床二期的有9款，臨床一期有17款，申請臨床的有3款，臨床前研究的有59款，藥物發(fā)現(xiàn)階段的有1600多種。

       國內外企業(yè)對KRAS抑制劑的開發(fā)熱情一直很高，國外的Revolution Medicines、Singh Biotechnology、Mirati Therapeutics、Wellspring Biosciences、Erasca、Array BioPharma、Eli Lilly等和國內企業(yè)加科思、百濟神州、再鼎、益方、勁方、信達、思路迪、濟民可信、瓔黎、澤璟、貝達、亞盛、艾力斯等均在該領域進行布局。

       本文主要介紹兩家企業(yè)——安進和Mirati在開發(fā)KRAS抑制劑方面的研究進展。

       安進的KRAS抑制劑研發(fā)

       安進有一款被FDA批準的KRAS G12C的抑制劑Sotorasib，用于治療既往至少接受過一次系統(tǒng)治療的攜帶KRAS G12C突變局部晚期或轉移性非小細胞肺癌（NSCLC）患者。除此之外，臨床上也在開展Sotorasib對其它疾病的治療效果研究，圖5為Sotorasib的全球研發(fā)進展。

       圖5. Sotorasib全球研發(fā)狀態(tài)

       Sotorasib不可逆鎖定KRAS處于不活躍的GDP綁定狀態(tài)，如圖6所示。與ARS-1620相比，ARS-1620是KRAS G12C的第一種直接抑制劑，其占據(jù)較小的口袋且效力較低，AMG510通過His95凹槽增強了其與KRAS的結合（G12C），效力提高約10倍。

       圖6. KRAS抑制劑結構與結合模式

       除了Sotorasib之外，安進也開發(fā)了很多不同種類的KRAS G12C抑制劑，同時也在開發(fā)KRAS G12D抑制劑。表1整理了安進公司報道的關于KRAS抑制劑的專利，由此可看出安進主要開發(fā)KRAS G12C共價抑制劑，主要改變Sotorasib的骨架和取代基結構，如把Sotorasib的吡啶并嘧啶酮骨架改成異噻唑并吡啶、2-甲基吡啶并二氮雜膦-2-氧化物、萘啶酮、吡啶并噻嘧啶 2、2-二氧化物等新型結構骨架，并且改變取代基位置和類型，但是對于KRAS G12C抑制劑都保留了丙烯酮結構。近期安進也在開發(fā)KRAS G12D抑制劑，骨架結構與MRTX1133相似，但是去除丙烯酰基共價結構。

       表1. 安進報道的關于KRAS抑制劑的專利

       同時，安進也發(fā)表了一些KRAS抑制劑的聯(lián)合治療策略（WO2020106647 A2，WO2021076655 A1，WO2013142182 A2，WO2022261025 A1，WO2015070224 A2），聯(lián)合治療不僅可以提高藥效，也可以克服KRAS抑制劑耐藥性問題。

       Mirati公司發(fā)表的專利

       除了安進之外，Mirati也是目前研發(fā)KRAS抑制劑中一家很有競爭力的公司。Mirati是一家處于臨床階段的生物技術公司，正在開發(fā)一系列新型療法，直接針對癌癥的遺傳和免疫驅動因素，以幫助改變癌癥患者的生活。

       Mirati不僅研發(fā)了被FDA批準上市的KRAZATI（Adagrasib，MRTX849），還發(fā)現(xiàn)了選擇性靶向KRAS G12D的強效化合物MRTX1133，標志著KRAS另一更常見的突變位點G12D或將有藥可用。

       Mirati Therapeutics Inc開發(fā)的Adagrasib是第二款被FDA批準上市的KRAS G12C抑制劑，它于2022年12月12日被美國FDA批準用于治療轉移性非小細胞肺癌患者。Krazati推薦劑量為每天兩次600mg，按照每瓶200mg劑量，每月需19750美元 。相比之下，Lumakras的成本略低，標價為每月17900美元。

       Adagrasib選擇性地靶向與GDP結合的KRAS中的突變半胱氨酸12，該半胱氨酸存在于KRAS G12C的switch II口袋中，從而將其鎖定為非活性的GDP結合狀態(tài)并抑制RAS/MAP激酶途徑，下圖為Adagrasib的全球研發(fā)進展。

       圖7. Adagrasib全球研發(fā)狀態(tài)

       MRTX1133被鑒定為有效、有選擇性、具有皮摩爾結合敏感性的KRAS G12D的非共價抑制劑。KRAS的Asp12（G12D）具有比半胱氨酸的巰基弱的親核基的羧基。這種差異導致化合物，如MRTX849，對KRAS G12C有重要影響，但不作用于KRAS G12D。

       MRTX1133用哌嗪代替MRTX849的親電受體丙烯酰胺結構與Asp12的羧酸形成鹽橋。MRTX1133結合到switch II口袋和抑制KRAS下游途徑的激活所必需的蛋白質-蛋白質相互作用[2]，下圖為MRTX1133的全球研發(fā)進展。

       圖8. MRTX1133全球研發(fā)狀態(tài)

       表2整理了Mirati公司申請的KRAS抑制劑的專利，可以看出Mirati不僅開發(fā)針對KRAS G12C突變的抑制劑，也開發(fā)針對KRAS G12D突變的抑制劑以及pan-KRAS抑制劑。從表2可以看出他們開發(fā)的KRAS抑制劑，主要圍繞四氫吡啶并嘧啶或者吡啶并嘧啶骨架。

       表2. Mirati公司申請的KRAS抑制劑的專利

       除此之外，Mirati公司也申請了KRAS抑制劑與其它抑制劑聯(lián)用的專利，如KRAS和MEK抑制劑（WO2022165142）、KRAS和SOS1抑制劑（WO2022251193）、KRAS和CDK4/6抑制劑（WO2020055758）、KRAS和mTOR抑制劑（WO2020055761）、KRAS和SHP-2抑制劑（WO2020118066）、KRAS和Raf抑制劑（WO2020055760）、KRAS和Src抑制劑（WO2020055755）、KRAS和pan ErbB抑制劑（WO2020055756）等。

       KRAS的PROTACs

       目前關于KRAS靶向藥物的研究越來越多，已經(jīng)取得了很大進展，有大量抑制劑、聯(lián)合方法和新的替代靶向方法（如PROTACs）正在臨床前或臨床研究中。

       近年來，隨著靶向蛋白降解（TPD）技術的發(fā)展，針對KRAS設計PROTAC的研發(fā)也陸續(xù)被報道（KRAS G12C/G12D-PROTAC）。2019年，Arvinas報道基于KRAS G12C抑制劑ARS-1620和VHL配體設計合成一系列KRAS的PROTACs，如化合物1（圖9）。在NCI-H2030細胞中，化合物1在1mM濃度時降解超過50%的KRAS蛋白。

       2020年，Gray等人報道基于ARS-1620與CRBN配體的KRAS的PROTACs，如化合物2（圖9），但令人遺憾的是，化合物2僅誘導降解人工GFP-KRAS G12C融合蛋白，但不降解內源性KARS G12C，這可能是由于降解劑無法有效地多泛素化內源性KRAS G12C。

       2020 年，Crews小組還報道了基于KRAS共價抑制劑MRTX849和VHL配體設計合成的“First-in-class”內源性KRAS G12C降解劑。其中，降解劑3（LC-2，圖9）通過篩選被確定為最有效的KRAS G12C降解劑，在NCI-H2030細胞中可誘導快速和持續(xù)的內源性KRAS G12C降解（Dmax為80%，DC50為0.59μM）。

       最近，Chen等人基于KRas G12C-IN-3和泊馬度胺設計合成KRAS G12C降解劑，如降解劑4（KP-14，圖9），在NCI-H358細胞中表現(xiàn)出最 佳的KRAS G12C降解活性（DC50為1.25 μM）。

       此外，基于LC-2的結構，Lu等人替換其乙烯基部分以獲得一系列KRAS G12C降解劑。他們發(fā)現(xiàn)降解劑5（YF135，圖9）在H358和H23細胞中具有最 好的降解活性（DC50分別為3.61μM和4.53μM）[3]。

       近期，Zhang等人報道了基于AMG-510和VHL配體設計合成的PROTACs，如化合物6（圖9），可以降解KRAS蛋白[4]。

       圖9. KRAS的PROTACs

       杭州濟景醫(yī)藥2022年披露了一篇專利（WO2022140246A1），發(fā)現(xiàn)通過使用不同的連接鏈（長度或者類型不同）連接KRAS抑制劑和自噬適配器LC3B配體合成設計的雙功能分子，該分子能通過自噬溶酶體途徑降解KRAS蛋白，如化合物7-9（圖10）。表3顯示這些化合物在不同濃度時降解KRAS蛋白的能力，由表3可知化合物8降解能力最強。

       圖10. 化合物7-9結構

       表3. 化合物7-9降解KRAS G12C的能力

       2022年，珃諾生物（Ranok Therapeutics）揭露了一篇利用分子伴侶HSP90配體設計合成的Chaperone-mediated Protein Degraders（CHAMPs）來降解KRAS G12C蛋白，如化合物10（圖11，WO2022078414A1）?；衔?0由三部分組成，一部分結合KRAS G12C蛋白，一部分結合HSP90蛋白，這兩個部分由中間連接鏈連接。在LU65A細胞中明顯降解KRAS G12C蛋白水平（DC50 < 100 nM）。

       分子伴侶（Chaperone）又稱侶伴蛋白，是一類協(xié)助細胞內分子組裝和協(xié)助蛋白質折疊的蛋白質。分子伴侶包含許多不同的家族，如HSP60家族、HSP70家族、HSP90家族等，每個家族以不同的方式幫助蛋白質折疊。

       除了參與蛋白質折疊，在某些情況下，分子伴侶還可以識別錯誤折疊的蛋白質，并引導它們通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）降解。

       圖11. 化合物10的結構

       除此之外，Arvinas、BioTheryX、百濟神州與晶銳醫(yī)藥等公司也披露了KRAS-PROTACs相關信息。

       小     結

       KRAS突變蛋白在很多疾病中被發(fā)現(xiàn)，是一個熱門的腫瘤靶點，其市場潛力巨大?，F(xiàn)在已經(jīng)上市的兩款KRAS抑制劑Sotorasib和Adagrasib都是針對G12C突變的抑制劑，Mirati報道了一個高效的KRAS G12D選擇性抑制劑MRTX1133。目前關于KRAS G12D突變的實體瘤尚無標準靶向治療方案，在胰 腺癌領域，化療及免疫治療等方式也并未取得預期的療效。對于KRAS G12D突變的實體瘤，尤其是惡性程度極高的胰 腺癌，仍然有迫切的臨床治療需求未被滿足。

       一些報道中也提到，野生型KRAS抑制不太可能成為毒性障礙，甚至可能是有益的，所以現(xiàn)在也有很多企業(yè)在開發(fā)pan KRAS抑制劑。

       自三十多年前在肺癌中發(fā)現(xiàn)KRAS突變以來，KRAS靶向藥物的研發(fā)已經(jīng)取得了很大進展，目前有大量抑制劑、聯(lián)合方法和新的替代靶向方法正在臨床研究中。然而，關于KRAS G12C抑制劑的數(shù)據(jù)表明，這些藥物遠未達到治愈效果。至少部分原因在于單藥治療幾乎總是產生耐藥性。

       目前，人們正試圖通過垂直抑制KRAS通路的多個節(jié)點來克服耐藥性機制。此外，治療策略還包括抑制平行通路的組合策略，聯(lián)合免疫治療策略誘導持久的抗腫瘤記憶免疫反應。最后，人們也在不斷開發(fā)新方法以及新的治療策略來靶向KRAS，希望這些新的方法能夠在KRAS突變惡性腫瘤患者群體中實現(xiàn)長期尋求的治愈目標。

       參考資料：

       1. Marco H Hofmann , Daniel Gerlach , Sandra Misale , Mark Petronczki , Norbert Kraut, Expanding the Reach of Precision Oncology by Drugging All KRAS Mutants, Cancer Discov, 2022 Apr 1;12(4):924-937.

       2. Chunxiao Zhu , Xiaoqing Guan , Xinuo Zhang, Xin Luan, Zhengbo Song, Xiangdong Cheng, Weidong Zhang, Jiang-Jiang Qin, Targeting KRAS mutant cancers: from druggable therapy to drug resistance, Mol Cancer 2022 Aug 4;21(1):159.

       3. Ming He, Chaoguo Cao, Zhihao Ni, Yongbo Liu, Peilu Song, Shuang Hao, Yuna He, Xiuyun Sun, Yu Rao, PROTACs: great opportunities for academia and industry (an update from 2020 to 2021), Signal Transduct Target Ther 2022 Jun 9;7(1):181.

       4. Xiaoyi Zhang, Tong Zhao, Minghao Sun, Pei Li, Mengzhen Lai, Lingfeng Xie, Jiaying Chen, Jian Ding, Hua Xie, Jinpei Zhou, Huibin Zhang, Design, synthesis and biological evaluation of KRASG12C-PROTACs, Bioorg. Med. Chem. 78 (2023) 117153.