去年兩項大型臨床試驗顯示，GLP-1受體激動劑不僅能夠有效降低體重，還能夠改善肥胖相關(guān)的心血管和腎臟疾病，被《科學》雜志評為年度突破。

       GLP-1類似物是多肽藥物的一個重要類別，GLP-1藥物的成功推動了多肽藥物市場持續(xù)擴容，多肽制藥工藝研究成為當前多肽研究的前沿與熱點。

       多肽藥物簡史

       合成技術(shù)的進步推動多肽藥物開發(fā)

       多肽藥物是一種介于小分子化學藥物和大分子蛋白質(zhì)藥物之間的“獨特藥物”，由氨基酸組成。它們因具有較少的副作用、高度的特異性和優(yōu)異的療效而被廣泛關(guān)注。此外，多肽藥物的結(jié)構(gòu)明確且質(zhì)量可控，使其在藥物開發(fā)過程中更為可靠。

       小分子、多肽藥物、生物制劑優(yōu)缺點比較

       圖片來源：參考資料1

       1922年，第一種多肽藥物胰島素被引入市場，最初是從牛和豬的胰腺中提取的，用于治療糖尿病。

       1954年，化學家文森特·迪維尼奧首次完成了催產(chǎn)素和血管加壓素的全合成，并因此獲得1955年諾貝爾化學獎。

       1963年，固相多肽合成（SPPS）技術(shù)誕生，通過在固相上組裝氨基酸，實現(xiàn)了多肽合成的自動化，極大地促進了多肽藥物的開發(fā)。

       20世紀80年代多肽重組技術(shù)的出現(xiàn)，使大規(guī)模生產(chǎn)綠色多肽成為可能。

       得益于在制備技術(shù)、劑型與給藥途徑、緩釋技術(shù)等方面的重大突破，多肽藥物在醫(yī)藥領(lǐng)域的潛力正在逐漸得到實現(xiàn)。目前全球已有超過100種多肽藥物上市，200種多肽藥物正在臨床試驗階段，廣泛用于免疫學、腫瘤學、心血管疾病等多個治療領(lǐng)域。

       多肽藥物GLP-1類藥物（用于治療肥胖癥和糖尿?。┖蜕L 激素是多肽藥物市場中的典型代表，展示了這一領(lǐng)域的巨大潛力和發(fā)展前景。

       GLP-1爆火

       多肽需求增長，工藝研究成熱點

       目前，多肽重磅藥品主要集中于糖尿病領(lǐng)域。2022年司美格魯肽、度拉糖肽、門冬胰島素、賴脯胰島素、甘精胰島素銷售額超過20億美元。

       除減肥、糖尿病之外，其他疾病領(lǐng)域也有不少多肽暢銷藥，涉及多家大型制藥企業(yè)和生物技術(shù)公司。

       腫瘤領(lǐng)域，Ipsen(益普生)的蘭瑞肽、諾華的奧曲肽2022年銷售額都超過了10億美元。此外，諾華的放射 性多肽靶向腫瘤治療藥物Pluvicto自2022年3月獲得FDA批準以來快速放量，2023年銷售額有望突破10億美元，躋身重磅炸 彈行列。

       抗感染領(lǐng)域，輝瑞的Paxlovid曾在新冠病毒防治中發(fā)揮了重要作用，2022年銷售額更是達到了189美元，成為當年最暢銷的小分子藥品。

       罕見病也是多肽藥物的主戰(zhàn)場。梯瓦（Teva）研發(fā)并于1996年上市的格拉替雷曾是多肽藥物中最大的品種，2014年其全球銷售額達42.37億美元，用于治療多發(fā)性硬化癥(MS)。2023年6月28日，醋酸格拉替雷注射液（商品名：固派松）獲得在中國正式批準，適用于治療復發(fā)型多發(fā)性硬化（MS）成人患者。

       當然，近兩年最受關(guān)注的莫過于GLP-1類多肽藥物。GLP-1激動劑主要通過刺激胰島釋放葡萄糖依賴性胰島素發(fā)揮作用。其次，這類藥物還能減緩胃排空和抑制食欲。美國疾病控制與預防中心（CDC）的數(shù)據(jù)顯示，約有3500萬美國人患有2型糖尿病，全球糖尿病患者約4.6億，占全球總?cè)丝诘?.3%。這一數(shù)據(jù)體現(xiàn)了抗糖尿病藥物市場的巨大規(guī)模。

       最初，天然腸促胰島素并不適合作為藥物開發(fā)的候選物，但隨著對降糖尿藥物需求的增加，研究人員最終將GLP-1受體激動劑開發(fā)成藥物。

       司美格魯肽作為目前GLP-1激動劑的代表產(chǎn)品，通過在第2位上將甘氨酸替換為2-氨基異丁酸(Aib)以及十八烷二酸與Lys-26側(cè)鏈的連接，實現(xiàn)了對自然肽的有效改造。這種改造增強了其對蛋白水解酶DPP-4的抵抗能力，并通過脂肪酸部分與血清白蛋白高度結(jié)合，將人體內(nèi)半衰期延長至約7天。

       天然GLP-1及其多肽類藥物的序列和結(jié)構(gòu)。利拉魯肽是一種源自GLP-1的肽藥物，在其天然序列的第26位（K）進行了修飾。

       圖片來源：參考論文1

       目前司美格魯肽已獲批糖尿病和肥胖兩大適應癥，諾和諾德還在推進司美格魯肽在心血管疾病、NASH、CKD、PAD、阿爾茨海默病、心衰領(lǐng)域的臨床研究。

       由于需求激增，諾和諾德的司美格魯肽、利拉魯肽都出現(xiàn)短缺。應對產(chǎn)能供應不足的問題，諾和諾德擬在其位于丹麥希勒勒德的工廠增加原料藥（API）的生產(chǎn)能力，以支持諾和諾德在嚴重慢性病領(lǐng)域的未來產(chǎn)品組合。

       另一方面，行業(yè)需求的增加帶來多肽藥物CDMO的持續(xù)火熱。全球領(lǐng)先的CDMO企業(yè)正在大力發(fā)展多肽合成業(yè)務，進行多方位產(chǎn)能建設(shè)，以迅速填補多肽藥物產(chǎn)能需求。

       這也引發(fā)了全球?qū)Χ嚯乃幬锂a(chǎn)能的關(guān)注，多肽藥物工藝研究因此成為當前多肽研究的前沿與熱點。

       合成與改良

       多肽化學合成法成主流

       發(fā)現(xiàn)具有潛在治療作用的活性分子是肽類藥物開發(fā)的第一步，其次是通過化學或生物合成以及序列修改來提高其藥理學特性。最后，多肽藥物的量產(chǎn)則需要通過工業(yè)化生產(chǎn)才能實現(xiàn)。

       傳統(tǒng)多肽藥物的研發(fā)主要采取生物發(fā)酵法，存在著生產(chǎn)成本高、純度低、穩(wěn)定性差等問題。隨著多肽合成技術(shù)的不斷進步，現(xiàn)代多肽藥物的研發(fā)主要依賴于人工合成。

       實驗室合成多肽藥物相對簡單，但在進行多肽工業(yè)化生產(chǎn)時需要考慮多方面的問題，包括技術(shù)應用、生產(chǎn)工藝、過程控制、產(chǎn)量規(guī)模、設(shè)備需求、生產(chǎn)成本、質(zhì)量管理、環(huán)保要求等。其主要技術(shù)挑戰(zhàn)在于提純難度較大且過程控制要求高，同時還需要考慮產(chǎn)量規(guī)模、生產(chǎn)布局與設(shè)備需求，控制生產(chǎn)成本。同時多肽藥物生產(chǎn)需要遵循嚴格的質(zhì)量管理規(guī)范，符合法律法規(guī)的要求，最后要重視環(huán)保要求，提高資源利用效率，減少廢棄物產(chǎn)生。

       綜上考慮，在已有的多肽合成方法中，目前已上市的多肽藥物多數(shù)是通過化學合成法制備，并且固相合成工藝占主導。據(jù)肽研社統(tǒng)計，截至2021年11月，68.8%的多肽分子通過化學合成方法制備，22.8%通過生物合成法獲得。固相合成法具有粗產(chǎn)品收率和純度高，研發(fā)周期短等優(yōu)點，而且固相合成可以切成多個片段，分包給全球不同的生產(chǎn)服務商，再組裝成API，從而有效地規(guī)避風險。

       例如采用固相合成法合成縮宮素，高效、安全、環(huán)保、質(zhì)量好、自動化程度高，相比液相合成法在規(guī)模級工業(yè)化生產(chǎn)具有一定優(yōu)勢。此外，化學合成法在類似物合成方面有著與生物合成法無法比擬的獨特優(yōu)勢。通過化學合成法合成單鏈胰島素前體，可快速篩選胰島素類似物，增加化學多樣性，改善產(chǎn)物物理、化學特性，從而獲得新的治療特性，實現(xiàn)胰島素類似物的工業(yè)制造。

       固相肽合成（SPPS）技術(shù)由梅里菲爾德（Merrifield）于1963年開發(fā)。SPPS技術(shù)在方法論和合成材料方面得到了顯著改進，對現(xiàn)代肽生產(chǎn)起著至關(guān)重要的作用。

       SPPS通過在一個簡單的反應器中結(jié)合氨基酸偶聯(lián)和脫保護步驟，進一步促進了自動肽合成器的發(fā)明。與重組技術(shù)相比，SPPS得到的原始肽更為單一，不含其他生物化合物如酶、DNA和RNA片段、非相關(guān)蛋白和肽。此外，SPPS最終產(chǎn)品中的雜質(zhì)易于鑒定，因為它們主要來自合成過程中的不完全反應或副反應，使得后續(xù)純化相對簡單。

       SPPS包括一個循環(huán)，即將氨基酸的羧基與固態(tài)聚合樹脂偶聯(lián)，并從保護基團中釋放氨基（見圖4）。使用各種樹脂，如4-甲基苯乙烯基胺（HMBA）樹脂、王氏樹脂、2-氯三苯甲烷氯化物（CTC）樹脂和梅里菲爾德樹脂，來引入肽C末端的酰胺或游離羧基。現(xiàn)代肽工業(yè)通過將樹脂與不同的連接器偶聯(lián)，開發(fā)了各種功能性樹脂，使得在固相中合成長肽和肽環(huán)化成為可能。

       固態(tài)多肽合成（SPPS）原理示意圖

       圖片來源：參考資料1

       在合成過程中，氨基酸的氨基和側(cè)鏈通常通過不同的化學基團保護，這會導致肽聚集并降低原始肽的純度。兩種主要的SPPS策略：Fmoc-SPPS和Boc-SPPS，分別用于去除主要的氨基保護基團，即熒光甲氧基羰基（Fmoc）和叔丁氧羰基（Boc）。

       Boc-SPPS使用三氟乙酸溶液去除氨基保護基團，并使用氫氟 酸溶液切割最終的肽，但這些過程伴隨著刺激性氣味和毒性。Fmoc在較溫和的條件下可被去除，因此Fmoc-SPPS策略通常更受青睞。然而，對于長肽合成而言，Boc-SPPS有其優(yōu)勢，因為三氟乙酸脫保護有效地破壞了肽合成過程中的聚集。

       Fmoc-SPPS研究目前專注于解決兩個主要問題，包括長肽合成過程中的聚集和某些序列中天冬酰亞胺的形成。

       長肽合成過程中的聚集問題，可采取使用低取代樹脂分離肽鏈、使用微波減少反應時間、混合溶劑作為反應溶液以及使用偽脯氨酸打破肽鏈骨架的氫鍵等方法，以避免或減少SPPS過程中的聚集。

       天冬酰亞胺在Fmoc-SPPS過程中的形成顯著降低了原始肽的純度。減少天冬酰亞胺形成的解決方案包括使用微波減少反應時間、使用N-α-烷基天冬酸-甘氨酸二肽或在脫保護過程中添加1-羥基苯并三唑（HOBt）、Oxyma Pure。

       固態(tài)多肽合成已成為目前多肽合成的首選，但固相合成仍存在許多缺點：

       縮合及洗滌過程中對環(huán)境不友好的溶劑(DCM和DMF等)和縮合劑的大量使用使得成本過高并引起浪費。因此當合成大規(guī)模的短肽時,液相合成法（LPPS）相對更合適。而且隨著液相+flow技術(shù)的發(fā)展，LPPS也將是未來多肽藥物公斤或噸級規(guī)模生產(chǎn)的重要工藝路線。

       固相多肽合成的難度屬于序列依賴性，盡管合成能力上限一直在不斷提高，但長于50個氨基酸的肽（尤其是在大規(guī)模制造中）仍然難以通過固相合成一次性獲取。片段合成法是近年來發(fā)展較快的多肽合成方法，其化學專一性在長肽合成領(lǐng)域具有突出作用。片段合成法的核心思想是將目標肽合理地分為若干片段，在合成這些片段后進行連接縮合，最終得到目標肽。目前，應用最廣泛的連接技術(shù)是自然化學連接（NCL）。該技術(shù)由芝加哥大學的Kent等于1994年提出，通過一個多肽片段的C-端硫酯與另一個N-端Cys多肽片段的選擇性化學反應，在連接位點處形成天然酰胺鍵。早期， C-端硫酯的合成受到穩(wěn)定性差的困擾，近年來通過酰肼氧化的C-端硫酯原位合成及連接策略極大地促進了這一方法的應用。多肽片段合成的其他連接方式還有天然化學連接、化學區(qū)域選擇連接、可去除輔助基連接、光敏感輔助基連接、施陶丁格連接和正交化學連接等。此外，在多肽片段合成法中，企業(yè)可以片段外包，分包生產(chǎn)。CDMO可以提供多種服務，包括多肽片段的合成、純化、結(jié)構(gòu)鑒定、質(zhì)量控制等。因此肽片段合成法已經(jīng)成為多肽藥物制備的重要手段之一。

       盡管固相合成是目前多肽工藝生產(chǎn)的主要方式，但液相合成也有不可替代的優(yōu)勢。不同于經(jīng)典的液相多肽合成，如今的液相手段增加了可溶性C-端標簽（Tag）策略，但因其標簽巨大的親脂性，可以通過簡單的沉淀、過濾或萃取得到這些多肽-標簽的加合物中間體，從而實現(xiàn)類似于固相合成的洗脫法去除過量試劑和副產(chǎn)品的目的。此外，液相+flow技術(shù)的興起為化學合成多肽提供了新的方法，可以解決傳統(tǒng)單純固相SPPS合成，溶劑用量高，排放高的問題，同時液相flow技術(shù)還將進一步提高生產(chǎn)工藝效率。

       隨著對多肽研究的不斷深入，多肽合成長度和化學修飾復雜程度不斷提高，對多肽合成工藝水平提出了更高要求，單一的合成方法往往不能滿足需求，研究者常將多種方法結(jié)合使用。例如諾和諾德的司美格魯肽采取發(fā)酵+固相合成，該方法通過發(fā)酵法制備GLP-1前體分子，然后通過固相法制備最終產(chǎn)物司美格魯肽。禮來的替爾泊肽便采用固相+液相多肽合成方法，先通過固態(tài)合成某幾個片段，再通過液相合成最終的產(chǎn)物。

       多肽藥物由于技術(shù)門檻較高，主要玩家多為深耕多肽領(lǐng)域多年的專業(yè)企業(yè)。國際老牌知名多肽原料藥生產(chǎn)企業(yè)包括Bachem、Polypeptide等憑借項目經(jīng)驗、地緣優(yōu)勢、客戶關(guān)系和政策壁壘，長期占據(jù)壟斷地位。

       近年來，隨著我國企業(yè)在多肽領(lǐng)域的不斷投入和努力，多肽生產(chǎn)技術(shù)不斷發(fā)展提升。目前我國已成為多肽原料藥出口大國，同時生產(chǎn)的多肽原料藥逐漸從低端產(chǎn)品逐漸轉(zhuǎn)向氨基酸個數(shù)更多和結(jié)構(gòu)更加復雜的中高端產(chǎn)品，代表企業(yè)包括諾泰生物、昂博等老牌多肽企業(yè)，以及博騰等新一代具備多肽研發(fā)生產(chǎn)能力的CDMO企業(yè)。

       小結(jié)

       多肽藥物憑借其作為天然生物分子的獨特屬性，對人類的高度特異性和低毒性，已成為創(chuàng)新藥的新重點。隨著需求的增加，多肽制藥工藝研究成為當前多肽研究的前沿與熱點，特別是化學合成法的廣泛使用極大地提高了多肽藥物的工業(yè)化效率。但同時也應當注意到多肽制藥工藝存在試劑用量多等諸多問題與挑戰(zhàn)，需要多肽藥物研究者與從業(yè)者共同努力不斷改進。

       隨著綠色多肽工藝的開發(fā)和應用、人工智能自動化控制技術(shù)等新技術(shù)與多肽合成工藝的有效融合，多肽制藥工藝將得到進一步發(fā)展和提高，助推更多的多肽藥物進入市場造福更多大眾。