PART.

       01

       背景介紹

       人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）是由肝實質(zhì)細胞合成并釋放到血液中的一種蛋白質(zhì)，占血漿總蛋白40%-60%。因為具有良好的血清穩(wěn)定性和半衰期，擁有多個配體結(jié)合位點、可逆結(jié)合藥物等特點，因此HSA一直被認為是一種天然藥物載體蛋白，可以延長血漿中藥物半衰期[1]。例如，HSA與胰島素類似物Levemir®，胰高血糖素樣1型（GLP-1）激動劑Victoza®等藥物的可逆結(jié)合，有效延長了這些藥物對糖尿病的治療效果[2]。同時作為一種替代策略，長效藥物納米顆粒白蛋白結(jié)合紫杉醇（Abraxane®）也已被批準用于癌癥臨床治療[3]；利用與HSA基因融合方法， GLP-1受體激動劑Albiglutide已被批準在包括歐盟和美國在內(nèi)的多個地區(qū)治療II型糖尿病[4]。自然狀態(tài)下藥物與白蛋白的結(jié)合效率并不高。藥物通過抗體與白蛋白的非共價結(jié)合，或通過基因結(jié)構(gòu)域融合等方法在一定程度上延長了藥物在體內(nèi)的半衰期、增加了藥物負載和療效（圖1A）。

       FcRn（neonatal Fc receptor）是位于細胞膜表面的IgG受體，最初被發(fā)現(xiàn)參與新生兒通過胎盤從母體獲得被動免疫。FcRn的蛋白結(jié)構(gòu)與MHC-I 分子類似，是由α鏈和β2微球蛋白非共價結(jié)合組成的異二聚體，在體內(nèi)多種組織上皮細胞、內(nèi)皮細胞及多種免疫細胞中廣泛表達[5]。FcRn可與IgG抗體的Fc結(jié)構(gòu)域結(jié)合，可阻止IgG分子被溶酶體降解。其內(nèi)在機制為FcRn與IgG的結(jié)合具有pH依賴性。血管內(nèi)皮細胞通過內(nèi)吞作用，將血清中的IgG攝入細胞內(nèi)，IgG與FcRn在酸化的內(nèi)體（endosome，pH6.0-6.5）中高效結(jié)合，并跟隨FcRn轉(zhuǎn)運至細胞膜表面。在中性（pH7.0-7.5）或微堿性（pH7.35-7.45）的細胞外血液中，IgG與FcRn發(fā)生解離，重新被釋放回血液循環(huán)中，因此FcRn與IgG在不同pH環(huán)境下的結(jié)合與解離能力可影響血清中IgG抗體的半衰期[6]。通過對抗體Fc結(jié)構(gòu)域進行位點特異性突變，可以改善IgG分子在體內(nèi)的藥物動力學和藥效特性。但是過度延長IgG藥物的半衰期也容易通過補體、FcR等途徑過度激活人的天然免疫系統(tǒng)，導致臨床效果并不理想。另外過多的突變位點也可影響抗體Fc結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性及免疫原性。

       白蛋白介導的藥物半衰期在某種程度上依賴于與內(nèi)源性FcRn的相互作用。研究顯示，F(xiàn)cRn同樣可結(jié)合白蛋白。在平衡條件下，F(xiàn)cRn與IgG以2:1的比例結(jié)合，白蛋白的其他位點與FcRn以1:1的比例結(jié)合，F(xiàn)cRn對白蛋白的內(nèi)在保護機制與IgG 類似，同樣以pH依賴的方式將白蛋白釋放回血液中參與體內(nèi)循環(huán)（圖1 B C），而且這種結(jié)合本質(zhì)上是疏水的[7]。FcRn的存在極大延長了白蛋白在血漿中的半衰期[1]。通過調(diào)節(jié)FcRn與白蛋白的條件性結(jié)合已經(jīng)逐漸成為一種極具吸引力的藥物傳遞技術(shù)。多種藥物通過直接與Fc/HSA進行融合或耦聯(lián)、或通過改造Fc/HSA與FcRn的結(jié)合力度，在一定程度上延長了藥物在血清中的半衰期和藥效[8]。但是通過小鼠模型來研究發(fā)現(xiàn)，HAS和MSA（小鼠血漿白蛋白）跟鼠FcRn存在競爭性結(jié)合，導致HSA與鼠FcRn之間的相互作用很弱，HSA的半衰期并未得到有效改善[9]。因為單人源化HSA的小鼠模型并不利于臨床前研究。所以雙人源化的FcRn與Albumin嚙齒動物模型對于模擬人體生理狀態(tài)藥物代謝及長效藥物開發(fā)顯得尤為重要。

       圖1. 血清白蛋白依賴的長效藥物機理

       PART.

       02

       FcRn/Albumin雙人源化小鼠模型

       與白蛋白相關(guān)長效抗腫瘤藥物開發(fā)

       為了支持血清白蛋白（HSA）介導的長效藥物研發(fā)，未來模式已經(jīng)成功開發(fā)了FcRn/Albumin雙人源化小鼠模型。該模型的設(shè)計旨在模擬HSA與FcRn在人體內(nèi)的表達和代謝模式，為藥物研發(fā)提供了重要的實驗平臺。具體來說，圖2展示了FcRn基因人源化策略和表達驗證結(jié)果。Western雜交實驗結(jié)果表明，人FcRn在肝臟組織中得到了穩(wěn)定的表達，而在野生型小鼠中沒有檢測到人FcRn的表達。同時，圖3還展示了Albumin基因人源化策略和表達驗證結(jié)果，Elisa實驗結(jié)果表明，在小鼠血清中，HAS表現(xiàn)出接近生理水平的表達。

       圖2. FcRn基因的人源化及其在肝臟的表達

       圖3. Albumin基因人源化及其在小鼠血清的表達

       這一雙人源化小鼠模型在白蛋白相關(guān)長效抗腫瘤藥物的開發(fā)中具有重要意義。在藥物研發(fā)中，一種常見的策略是使用雙特異抗體分子，這些分子可以特異性地結(jié)合兩個不同的抗原分子。尤其對于靶向CD3T細胞和腫瘤細胞的雙特異抗體分子，由于其容易引發(fā)Fc介導的細胞毒性，研究人員開始探索不包含F(xiàn)c部分的CD3雙特異抗體分子[10]。IMB45400是某公司開發(fā)的無Fc端雙特異抗體分子。然而，該分子在體內(nèi)半衰期較短。為了解決這一問題，研究人員開發(fā)了可以共價結(jié)合HSA的CD3雙特異抗體分子(IMB454001)。在FcRn/Albumin雙人源化小鼠體內(nèi)，IMB454001的半衰期比IMB45400提高了11倍。這種結(jié)合了HSA的雙特異分子提高了藥物的安全性，同時改善了其體內(nèi)藥理動力學表現(xiàn)，如圖4所示。

       圖4. 通過與HSA結(jié)合提高CD3雙特異抗體藥物在FcRn/Albumin雙人源化小鼠體體內(nèi)藥物動力學

       類似的設(shè)計策略也可以應(yīng)用于其他重組蛋白藥物，例如，納米抗體和細胞因子的分子量比較小，其自身可以被工程化以改善其藥代動力學。通過與HSA的融合或者增強與HAS的親和有助于提高這些分子的穩(wěn)定性，降低在體內(nèi)的降解速率，從而延長它們的半衰期，提高藥物效果。與Fc融合蛋白相比，HSA結(jié)合蛋白藥物在提高藥物安全性方面具有優(yōu)勢，因為Fc部分可能引發(fā)不需要的免疫反應(yīng)。同時，HSA還可以用于將多個藥物或分子結(jié)合到一個載體中，實現(xiàn)多功能性藥物特性，從而增強治療效果。

       在細胞基因治療（CGT）方向，許多藥物也可以通過與HSA的結(jié)合來延長其半衰期。外泌體（extracellular vesicles，EVs）是一類細胞分泌的小型膜囊泡，包含蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和其他生物分子，對細胞間通信、疾病傳播和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。例如，某些公司通過基因改造外泌體，使其具有高度親和HSA的特性，從而顯著延長其在體內(nèi)的藥物動力學，增加了藥效，如圖5所示。這種策略有助于改善外泌體作為一種藥物輸送工具的性能，增加了外泌體在藥物輸送中的應(yīng)用前景。

       圖5. 基因工程改造的外泌體及其在FcRn/Albumin雙人源化小鼠體內(nèi)的藥代研究

       此外，HSA還可以應(yīng)用于小核酸藥物的研發(fā)，這類藥物包括siRNA（小干擾RNA）和miRNA（微小RNA）。它們在肝臟疾病治療中廣泛應(yīng)用，尤其是在遺傳性肝病和病毒感染方面。然而，siRNA的藥物動力學需要改進，以確保它們能夠準確地作用于目標細胞而不被迅速代謝和排泄。例如，通過適配體(aptamer)可以增加HAS和小核酸藥物之間的親和力，從而增強HSA對siRNA的保護作用，如圖6[11]。這個領(lǐng)域的研究和開發(fā)是不斷發(fā)展前進的，已經(jīng)有一些創(chuàng)新藥物問世。Inclisiran是一種用于控制膽固醇水平的siRNA藥物，被設(shè)計為通過HSA在體內(nèi)輸送，以減少LDL膽固醇水平。Miravirsen是一種miRNA抗體藥物，用于治療丙型肝炎病毒（HCV）感染，它被設(shè)計為與HSA結(jié)合，提高了藥物的穩(wěn)定性并延長在體內(nèi)的生命周期。Nusinersen是用于治療脊髓肌肉萎縮癥的藥物，是一種修飾的小干擾RNA，與HSA結(jié)合以延長在體內(nèi)的藥物效應(yīng)。

       圖6. 通過適配體(aptamer)可以增加ssRNA的藥物動力學

       這些藥物的應(yīng)用領(lǐng)域各不相同，但它們共同利用了HSA的長效性質(zhì)，以提高藥物的療效和/或降低副作用。此外，該領(lǐng)域仍在不斷發(fā)展，可能還有其他HSA相關(guān)的長效藥物在臨床中開發(fā)。

       為了便于研究這些藥物在人免疫系統(tǒng)和腫瘤相互作用中的藥效，未來模式還將雙人源化小鼠與免疫缺陷小鼠NV-NSG進行交配。這一交配策略的目的是創(chuàng)建具有免疫缺陷但同時具備HSA介導的長效藥物代謝的小鼠模型，以更準確地模擬藥物在人體內(nèi)的表現(xiàn)。通過將雙人源化小鼠與NV-NSG小鼠進行交叉，研究人員可以獲得同時具備FcRn/Albumin雙人源化和免疫缺陷特征的模型。這種模型使研究人員能夠更好地理解藥物在免疫受體上的相互作用，以及其在人源免疫環(huán)境中的藥效。這對于抗腫瘤藥物的開發(fā)和評估具有重要意義，因為藥物在免疫系統(tǒng)和腫瘤細胞之間的相互作用對其療效產(chǎn)生重要影響。

       總之，HSA及FcRn/Albumin雙人源化小鼠模型在白蛋白相關(guān)長效抗腫瘤藥物以及小核酸藥物的研發(fā)中具有關(guān)鍵作用。這一模型提供了寶貴的工具，可用于研究和優(yōu)化不同類型的長效藥物，從而有望提高藥物的療效，延長藥物在體內(nèi)的生命周期，并增加治療的成功率。