Nature：閆創(chuàng)業(yè)/袁亞飛團隊揭示去甲腎上腺素轉運蛋白再攝取與抑制的分子基礎

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來源：生物世界

2024-07-25

去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）和血清素（5-HT）是重要的單胺類神經遞質，影響著包括運動、激素分泌、獎懲和情緒相關的復雜行為和生理過程。這些神經遞質在突觸前膜去極化后釋放到突觸間隙，隨后激活突觸后膜上的受體并觸發(fā)影響神經元興奮性、突觸可塑性和各種生理過程的細胞內信號級聯(lián)。

去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）和血清素（5-HT）是重要的單胺類神經遞質，影響著包括運動、激素分泌、獎懲和情緒相關的復雜行為和生理過程。這些神經遞質在突觸前膜去極化后釋放到突觸間隙，隨后激活突觸后膜上的受體并觸發(fā)影響神經元興奮性、突觸可塑性和各種生理過程的細胞內信號級聯(lián)。正常生理情況下，從突觸前神經元釋放的神經遞質，在完成信號傳導后必須及時高效地從突觸間隙被清除，從而實現(xiàn)信號終止。通過突觸前神經元或者神經膠質細胞質膜上的單胺類神經遞質轉運蛋白（MAT），可以將單胺類神經遞質再攝取回突觸前膜從而終止其對下游受體的激活狀態(tài)。目前，MAT家族抑制劑主要在醫(yī)藥市場上用作抗抑郁藥，可根據其化學結構和作用方式分為不同的類別（圖1）。

圖1：單胺能神經元中神經遞質的傳遞過程及不同抗抑郁藥物的作用方式

MAT屬于神經遞質鈉同向轉運蛋白（NSS）家族成員，其利用膜外/內鈉離子Na⁺的濃度梯度來完成對神經遞質的同向跨膜運輸，這一過程可能依賴于氯離子Cl^-同向轉運以及鉀離子K⁺的反向轉運。近年來對MAT中底物轉運及抗抑郁藥物調節(jié)機制的研究進展迅速，其中果蠅多巴胺轉運蛋白dDAT和人源血清素轉運蛋白SERT的不同構象以及與多種抗抑郁藥物分子結合的結構已經得到解析。但關于人源去甲腎上腺素轉運蛋白NET的結構研究相對進展緩慢，這大大阻礙了抗抑郁藥物的進一步優(yōu)化和開發(fā)。

2024年7月24日，清華大學生命科學學院/北京生物結構前沿研究中心閆創(chuàng)業(yè)/袁亞飛團隊在 Nature期刊發(fā)表了題為：Molecular basis of human noradrenaline transporter reuptake and inhibition（人類去甲腎上腺素轉運蛋白再攝取與抑制分子基礎）的研究論文。

該研究通過結構生物學和生物化學方法闡明了去甲腎上腺素轉運體（NET）轉運底物去甲腎上腺素（NE）和多巴胺（DA）的機制，首次報道了NET中的第二個底物結合位點和NSS家族的鉀離子結合位點，揭示了四種不同類別的常用上市抗抑郁藥物的選擇性抑制機制，為進一步開發(fā)靶向單胺類神經遞質轉運蛋白（MAT）的藥物奠定了基礎。

Molecular basis of human noradrenaline transporter reuptake and inhibition（人類去甲腎上腺素轉運蛋白再攝取與抑制分子基礎）的研究論文

研究團隊利用冷凍電鏡技術成功解析了人源NET蛋白的八個高分辨率結構，包括天然狀態(tài)、結合底物（NE、DA）和四種常用上市抗抑郁藥物（托莫西汀：Atomoxetine，ATX；地昔帕明：Desipramine，DSP；艾司西酞普蘭：Escitalopram，ESC；安非他酮：Bupropion，BPP）的結合狀態(tài)。這些結構是天然蛋白在未使用任何基準標記或突變的情況下獲得，分辨率在2.5到3.5埃之間（圖2）。

圖2：人源NET天然狀態(tài)、結合兩種底物和四種抗抑郁藥物復合物的冷凍電鏡結構

研究發(fā)現(xiàn)，NET中央口袋S1處識別NE或DA的方式與報道的果蠅dDAT不同，其兒茶酚環(huán)上的兩個羥基主要通過水介導的氫鍵識別（圖3a，b）。此外，研究在NET與兩種底物結合的結構中都觀測到了第二個底物的密度（S2位點）。值得注意的是，與已報道的SERT中的S2位點顯著不同，NET中的S2位點位于TM1b C末端，且僅存在于向內閉合或開放的構象中，向外開放構象轉變會導致S2位點被破壞（圖3c）。通過生化實驗發(fā)現(xiàn)，S2位點內的某些突變顯著影響轉運蛋白的轉運速度。推測NET中S2位點的功能可能是提前加載底物，從而加快底物轉運效率。

圖3：NET中心口袋S1的底物結合方式（a-b）、S2位點（c）及K+離子結合位點（d）

MAT成員是離子耦合的膜蛋白，作為次級主動轉運蛋白，它們共享兩個保守的Na⁺結合位點（Na1和Na2）和一個保守的Cl-結合位點，利用跨膜離子梯度的能量來催動神經遞質的運輸（圖3a）。早在1979年時K⁺離子就被提出參與MAT的轉運循環(huán)，但直到現(xiàn)在實驗結構仍未確定特定的K⁺結合位點。研究團隊在向內開口的NET-DSP-KCl結構的Na1位點處發(fā)現(xiàn)了K⁺的額外密度，而該密度在NaCl條件下的NET內向開口構象中并不存在。據此，該研究首次通過結構驗證了NSS家族中K⁺離子的結合位點。這一K⁺離子位點恰好是Na1位點，該位點在向內開口釋放Na⁺離子之后，局部殘基構象發(fā)生改變，使得該位點更偏好螯合K⁺離子（圖3d）。盡管確認了Na1處K⁺的存在及其在運輸中的作用，但其觸發(fā)構象轉變的確切機制仍需要進一步研究。

深入了解不同抗抑郁藥物對MAT的選擇性抑制的分子基礎對于抗抑郁藥物的開發(fā)和應用具有重要意義。托莫西汀是一種NE再攝取抑制劑（NRI），其對NET的選擇性比SERT和DAT高約30倍和130倍；地昔帕明是三環(huán)類抗抑郁藥（TCA），其對NET的選擇性比SERT高約20倍；安非他酮是典型的NE和DA再攝取抑制劑（NDRI）；而艾司西酞普蘭是一種典型的選擇性血清素再攝取抑制劑（SSRI），其對SERT的選擇性比NET高約2600倍。

該研究通過解析四種不同類型的抗抑郁藥物的高分辨率結構，為理解其對NET、DAT和SERT選擇性提供了分子基礎。通過不同抑制劑濃度的[3H]-NE攝取測定，該研究進一步揭示了托莫西汀的競爭性抑制及其它三種抑制劑的混合型抑制機制與結合不同構象相關。這些研究為理解靶向MAT的抗抑郁藥物選擇性提供了重要見解，MAT抗抑郁藥獨特的結合模式和多靶點特性值得制藥行業(yè)特別關注。

綜上，研究團隊提出了NET的轉運過程模型（圖4）。在向外開放的構象中，Na⁺、Cl^-和底物NE與中央口袋結合，啟動NET的閉合，進入閉合狀態(tài)。在這個轉變過程中，第二個底物可以提前結合到新形成的膜外S2位點中。隨后，TM1a的打開（向內開放構象的標志特征）促進底物與兩個Na⁺一起從中央口袋釋放。在轉變回向外開放構象的過程中，S2位點的局部結構將受到破壞，導致S2位點處底物的釋放。釋放的底物可能直接進入到中央口袋，開始下一個轉運循環(huán)。這一過程與兩個Na⁺離子和一個Cl^-離子進入細胞質以及可能一個K⁺離子進入細胞外基質的轉運耦合。而不同類別的抗抑郁藥物占據S1位點阻礙底物轉運。