在COVID-19疫情背景下，mRNA疫苗的快速崛起讓RNA療法成為全球關注的焦點?；赗NA的疫苗創(chuàng)下了歷史上最快疫苗研發(fā)時間的記錄，從開發(fā)到獲FDA上市僅僅用時一年時間。發(fā)現(xiàn)了核苷堿基修飾的科學家更是憑此獲得了2023年諾貝爾獎。 

       然而，mRNA疫苗在持久性和免疫原性等方面展現(xiàn)出的局限性，促使科學界積極尋求新的突破。正是這樣的背景下，被譽為“mRNA 2.0”的環(huán)狀RNA（circRNA）以其獨特的優(yōu)勢被關注到。先進國際期刊Nature發(fā)文稱“circRNA是RNA療法的下一代重磅技術”。

       1976年，circRNA首次被發(fā)現(xiàn)，但當時被認為是細胞內mRNA剪接錯誤帶來的副產物。2013年，Nature期刊同期發(fā)表了兩篇研究論文，確立了circRNA是一類具有調控作用的非編碼RNA，可以通過作為miRNA的海綿來調控其他基因表達。這讓沉寂30多年的circRNA一鳴驚人，并陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)在細胞分化、組織穩(wěn)態(tài)、疾病發(fā)展，以及免疫代謝中發(fā)揮重要調節(jié)作用。 

       2018年7月，是circRNA發(fā)展史上的一個關鍵轉折點，麻省理工學院（MIT）的 Daniel Anderson 等人在 Nature Communications 期刊發(fā)表論文，首次證實工程化的circRNA可在真核細胞中穩(wěn)定、高效表達蛋白，開創(chuàng)了外源circRNA在真核細胞中表達蛋白的新應用，也證明了circRNA是線性mRNA的有效替代品。

▲ circRNA研究的里程碑事件

       線性mRNA疫苗雖然研發(fā)周期短且易于實現(xiàn)量產，但在RNA技術中有一個關鍵的缺陷，即其通常以線性形式存在，而這種形式存在的mRNA壽命很短。一般來說，在幾個小時之內，細胞內的核酸酶就會將其降解掉。對于mRNA疫苗而言，其短暫的壽命并非什么大問題，因為RNA只需要很短的時間就能編碼出蛋白質，從而引起免疫反應。

       而對于大多數(shù)治療來說，則需要讓RNA停留足夠長的時間才能具有更長的療效。這時候就需要在合成時對其進行大量修飾，以抵抗細胞內核酸酶的降解及避免引起先天免疫刺激，然后再通過脂質納米顆粒（LNP）遞送。整個過程效率低下，且價格昂貴。即便如此，修飾后的線性mRNA的半衰期還是較短。

       不同于線性mRNA，circRNA是一種獨特的單鏈RNA分子，其最顯著的特點在于其共價閉合的連續(xù)環(huán)形結構，原本在線性RNA分子中存在的3'和5'末端被巧妙地連接在一起，這與傳統(tǒng)線性RNA截然不同。這一獨特的環(huán)形結構賦予了circRNA諸多優(yōu)勢，不僅使其能夠有效抵御核酸酶的降解，還顯著提升了蛋白表達效率。同時，未修飾的circRNA具有較小的副作用，安全性能更高，且可以延長抗原遞呈時間并保持長久的免疫反應，即使在低劑量水平，也可以增加其治病潛力，從而制造成本也大大降低。

▲ circRNA的形成

       遞送策略上，circRNA的遞送通常采用LNP、外泌體和病毒樣顆粒。總體而言，目前circRNA的遞送仍然廣泛采用LNP系統(tǒng)。但LNP也存在一些不容忽視的缺點，比如具有肝臟積累的傾向，肝外應用受限等。外泌體和病毒樣顆粒則具有更強的生物兼容性。

       （關于外泌體如何賦能下一代CGT藥物開發(fā)，亦諾微創(chuàng)始人兼CEO周國瑛博士將于2024 年 9 月 4 日，在艾本德聯(lián)合醫(yī)麥客、ATLATL飛鏢創(chuàng)新研發(fā)中心舉辦的以“逐本未來，品質為先”為主題的沙龍活動--新一代 CGT 藥物創(chuàng)享交流會上分享。歡迎掃碼報名線上或線下參加。）

       circRNA作為下一代RNA療法的核心，有望治療各種難治性疾病，包括病毒性傳染病、腫瘤、病原菌感染、自身免疫性疾病、代謝性疾病等。

▲ circRNA的潛在應用

       蛋白質替代療法：其目的是恢復那些缺失或有缺陷的蛋白質功能，通常是由基因突變導致。采用mRNA治療內源蛋白缺失已應用于多種疾病。相對于mRNA，circRNA結構具有更高的穩(wěn)定性，蛋白質表達時間更長，從而可以產生較高的蛋白質累積并持續(xù)較長時間，減少給藥頻率，且免疫原性較低。

       杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD），是由于 X 染色體上編碼抗肌萎縮蛋白的基因突變所導致的遺傳病，患者無法產生足夠的抗肌萎縮蛋白。Orna Therapeutics公司發(fā)現(xiàn)了使用circRNA-LNP進行DMD的治療，可以實現(xiàn)持久高效的蛋白表達，甚至是長編碼區(qū)蛋白的表達，且編碼全長抗肌萎縮蛋白和截短體的circRNA均能在原代骨骼肌細胞中表達。

       疫苗：疫苗接種的目標是誘導強烈的適應性免疫反應和長期免疫記憶。適應性免疫記憶的誘導部分取決于抗原暴露的持續(xù)時間。與mRNA相比，circRNA固有的穩(wěn)定性延長了蛋白質翻譯的時間，增加了體內的蛋白質產量，長期表達抗原可以更有效地誘導具有持久免疫記憶的免疫反應。

       近日，復旦大學基礎醫(yī)學院璩良等人發(fā)表了一篇文章，詳細解析了通過注射編碼HER2特異性腫瘤抗原的circRNA疫苗增強circRNA-CAR介導的巨噬細胞和T淋巴細胞的抗腫瘤效應。

       癌癥免疫療法：采用機體免疫的作用成分如細胞因子、抗體和免疫細胞等進行癌癥的治療。circRNA在癌癥免疫治療領域展現(xiàn)出多重優(yōu)勢，包括其可用于腫瘤個性化治療、高穩(wěn)定性確?？乖鞍椎姆€(wěn)定表達，以及誘導更強的免疫反應。同時，circRNA固有的較低免疫原性對于腫瘤內免疫刺激蛋白表達更具優(yōu)勢。

       細胞因子作為一類小型蛋白信號分子，已被證實具有增強抗腫瘤效果的能力。其中，白細胞介素-12（IL-12），作為細胞介導免疫的有效誘導劑，具有刺激活化 T 細胞和 NKT 細胞的效應功能，在肺癌等實體瘤中顯示出良好的抗腫瘤作用。但由于它的脫靶毒性和給藥方式的低效性，其應用受到限制。近日，多倫多大學李博文團隊篩選出針對肺癌的H1L1A1B3 可電離脂質，將其整合進脂質納米顆粒（LNPs）。然后利用這些納米顆粒包封核酸，但包封的是 IL-12 circRNA，而不是IL-12 mRNA。將IL-12 circRNA 有效遞送到肺部腫瘤，并聯(lián)合免疫檢查點抑制劑治療（ICI），最終提高了肺癌免疫治療的效果。

       基因編輯：與mRNA相比，circRNA提供的穩(wěn)定性和穩(wěn)健表達可以使Cas9蛋白的持久性更長，增加的蛋白表達可能會顯著提高基因編輯效率。

       在ADARs介導的RNA編輯中，2022年，魏文勝課題組設計并運用了可招募ADAR的環(huán)形RNA（circ-arRNA），通過AAV遞送，遺傳編碼的circ-arRNA可以在人的原代細胞和類器官中實現(xiàn)長時程的RNA編輯，這種可避免核酸外切酶切割的環(huán)狀RNA進一步提升了體外和體內編輯的效率和精準性， 基本清除了雙鏈RNA區(qū)域內目標轉錄本上的脫靶。

       非編碼環(huán)狀RNA治療：circRNA在細胞內具有內源性非編碼功能，如miRNA和RNA結合蛋白海綿功能。circRNA作為調控RNA，具有作為miRNA和RNA結合蛋白的競爭性抑制劑從而進行治療的潛力。

       總的來說，circRNA 的潛力和市場的熱情預示著其光明的前景，但其仍存在一些挑戰(zhàn)。比如如何精準調控circRNA的表達水平，使其維持在適當?shù)墓δ芩蕉粫^量表達導致毒性，還需要進一步開發(fā)；對 circRNA 修飾需要進行更深入的研究來進一步降低circRNA的免疫原性。同時，遞送也是各應用的主要挑戰(zhàn)之一。相信隨著科研技術的不斷進步，circRNA技術的持續(xù)改進有助于其更廣泛的進入產業(yè)化階段。

       放眼全球，盡管這個賽道吸引了國內外企業(yè)紛紛布局，然而目前還未有真正的circRNA藥物上市，所有在研管線都處于臨床階段，已入局的玩家?guī)缀醵际莿偲鸩絼?chuàng)業(yè)的生物醫(yī)藥公司。

       同樣，這個風口也被MNC盯上，布局該領域的新銳公司都從融資市場攬獲了不小的支持。業(yè)內人士戲稱，2021年堪稱circRNA相關企業(yè)的融資元年。

       Orna Therapeutics是全球首家利用circRNA技術開發(fā)新療法的公司，主要項目是一種原位CAR療法，它結合了circRNA分子和LNP技術，將CAR直接遞送至患者體內的免疫細胞。據(jù)Orna Therapeutics官網所示，其主攻方向是利用circRNA的穩(wěn)定性制備原位CAR-T。

       另外，值得一提的是，Orna Therapeutics在人類細胞中實現(xiàn)了全長抗肌萎縮蛋白編碼RNA的非病毒遞送，以及在小鼠模型中實現(xiàn)了較小長度抗肌萎縮蛋白編碼RNA的體內遞送。

       Orna Therapeutics成立于2019年，成立之初便獲得了1000萬美元種子輪資金，2021年完成了1億美元的融資，截至2022年完成了2.21億美元的B輪融資，并與默沙東達成了一項總資金為36.5億美元的合作。

       著名風投機構Flagship于2021年投資5000萬美元創(chuàng)立了Laronde。Laronde同樣布局circRNA賽道，其核心技術是自主研發(fā)的eRNA環(huán)化技術。成立僅3個月，Laronde就獲得了4.4億美元的B輪融資，是迄今為止circRNA公司獲得的最大的一筆融資。

       2023年，Laronde宣布和Flagship孵化的一家納米載體Senda Biosciences合并成為一家新公司——Sail Biomedicines，將Laronde的環(huán)狀RNA平臺和Senda的可編程納米顆粒平臺結合起來，開啟全面可編程的藥物開發(fā)。

       不僅是國際上布局circRNA的企業(yè)在瘋狂吸金，國內不少企業(yè)也獲得了大筆融資。以圓因生物為代表的circRNA新銳企業(yè)，與國際企業(yè)齊頭并進，紛紛打造了各自的技術平臺。

       圓因生物是國內首家布局circRNA的企業(yè)，建立了體外高效制備高純度circRNA的技術平臺，針對新冠病毒及其變異株，設計了編碼新冠病毒刺突蛋白RBD的circRNA疫苗。2021年和2022年，圓因生物分別完成了超億元的Pre-A輪融資和2.8億元人民幣的A輪融資。

       除此之外，2021年成立的環(huán)碼生物也受到了資本的青睞，成為國內首家circRNA融資企業(yè)。截至目前，環(huán)碼生物已經完成了A輪融資，預估累計融資金額近4千萬美元。

       環(huán)碼生物擁有多項自主研發(fā)專利，如基于II型內含子自剪接核酶的活性可在體外環(huán)化任意RNA，其還建立了一套基于circRNA的高通量篩選系統(tǒng)可以高效篩選翻譯起始元件，并為circRNA建立了基于人工智能的序列優(yōu)化設計平臺。

       據(jù)悉，環(huán)碼生物曾接連兩度與MNC攜手。2023年7月，環(huán)碼生物與輝瑞就circRNA療法達成研發(fā)合作協(xié)議。今年2月，環(huán)碼生物宣布與BMS達成一項可行性研究合作。

       此外，國內企業(yè)先博生物和國外circRNA領頭羊Orna Therapeutics還達成了合作。除了上述幾家企業(yè)之外，其他代表性的企業(yè)還有科銳邁德、博雅輯因、吉賽生物、博安生物等也已經形成了具有獨特優(yōu)勢的技術平臺。

       在此背景之下，還有部分企業(yè)著眼于解決痛點、難點問題的核心專利技術上，如日前，艾博生物公布其自主研發(fā)的、擁有全球自主知識產權的高效RNA成環(huán)順式剪接系統(tǒng)（Cis系統(tǒng)），突破了海外PIE系統(tǒng)專利的限制，有望成為高效制備高質量circRNA的突破性技術。放眼未來，本土創(chuàng)新想要避免發(fā)生“mRNA專利戰(zhàn)”的前車之鑒，只有提早突破海外壁壘，才能有望在circRNA技術得到大規(guī)模應用之前，迅速搶占其帶來的無限潛力和廣闊的全球市場機遇。