手足口病（hand, foot, and mouth disease，HFMD）是一種常見(jiàn)的兒童傳染性疾病，其特征表現(xiàn)為發(fā)熱，口腔后部多發(fā)潰瘍及手、足底、臀部丘疹或皰疹，部分危重患兒可出現(xiàn)無(wú)菌性腦膜炎、急性弛緩性癱瘓、腦干腦炎、肺水腫、心肺衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥。HFMD具有高度傳染性，可通過(guò)糞-口途徑、直接接觸、間接接觸及呼吸道飛沫等途徑進(jìn)行傳播。目前，臨床上防治 EV71 感染缺乏特異、高效的藥物，常以對(duì)癥治療為主。所以，研發(fā)穩(wěn)定、有效的抗腸道病毒71型**顯得至關(guān)重要。

       目前，在研的EV-A 71**包括滅活全病毒**、減毒活**、病毒樣顆粒**、重組VP 1蛋白**和合成多肽**。但是，僅有滅活的EV-A 71全病毒**完成Ⅲ期臨床試驗(yàn)并已廣泛應(yīng)用。

       1、滅活全病毒**

       滅活全病毒**是利用理化方法處理人工大量培養(yǎng)的完整病毒，使其喪失感染性和**而保持其免疫原性，并結(jié)合相應(yīng)的佐劑而制成的**。迄今為止，中國(guó)大陸、中國(guó)臺(tái)灣、新加坡已開(kāi)發(fā)了完整的滅活全病毒EV-A71**。

       科興生物技術(shù)有限公司（Sinovac）、微谷生物技術(shù)有限公司（Vigoo）和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所（CAMS）于2010年至2011年完成滅活全病毒EV-A71**的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，2013年完成Ⅲ期臨床試驗(yàn)，并于2015年獲得我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)正式投入使用。這三個(gè)單位使用不同的病毒株開(kāi)發(fā)**，分別為：H07菌株、FY 7 VP 5菌株、FY- 23菌株，均屬于EV-A71 C 4亞型，是我國(guó)最常見(jiàn)的EV-71 A亞型。CAMS使用KMB-17人類(lèi)二倍體細(xì)胞作為細(xì)胞庫(kù)，使用細(xì)胞工廠擴(kuò)增EV-A71病毒，Vigoo和Sinovac使用Vero細(xì)胞作為細(xì)胞庫(kù)分別通過(guò)微載體生物反應(yīng)器和細(xì)胞工廠擴(kuò)增EV-A71病毒。三個(gè)單位均使用甲醛滅活EV-A71病毒，并添加鋁明礬佐劑來(lái)制備EV-A71滅活全病毒**。

       中國(guó)臺(tái)灣研制的滅活 EV-A 71 全病毒**采用 EV-A71 臨床分離株E59 菌株（B4亞型）。于2019年啟動(dòng)Ⅲ期臨床試驗(yàn)（ClinicalTrials.gov，編號(hào)NCT03865238），預(yù)計(jì)將于2022年完成。新加坡使用B 3亞型，已完成Ⅰ期臨床研究。研究表明，滅活EV-A71全病毒**具有良好的保護(hù)性和安全性，但僅能預(yù)防部分EV-A71感染，仍需進(jìn)行進(jìn)一步研究。

       2、減毒活**

       減毒活**是通過(guò)將微生物的自然強(qiáng)毒株通過(guò)物理、化學(xué)或生物學(xué)等方法進(jìn)行處理而制成的**，減毒活**喪失致病力或只引起亞臨床感染，但仍保持良好的免疫原性。研究者參照脊髓灰質(zhì)炎病毒減毒的策略對(duì)EV-A71 BrCr 株基因組 5'非編碼區(qū)、3D基因和 3'非編碼區(qū)進(jìn)行變異，得到EV-A71減毒株（S1-3'）。接種了EV-A71（S1-3'）的食蟹猴可在致死劑量的EV-A71攻擊下存活，產(chǎn)生針對(duì) EV-A71不同基因型（A、B1、B4、C2和C4型）的中和抗體，但部分猴子接種**后出現(xiàn)震顫，并在脊髓中分離出減毒病毒。

       研究表明，EV-A71減毒活**是可行的，但應(yīng)該進(jìn)一步改善**的安全性。近年來(lái)出現(xiàn)了一種使用密碼子去優(yōu)化病毒制備減毒**的方法，研究者將病毒特定氨基酸對(duì)應(yīng)優(yōu)選密碼子替換為與之對(duì)應(yīng)的最不優(yōu)選密碼子，使其雙核苷酸CpG和UpA水平升高，從而降低病毒的毒力及生存能力。研究顯示，通過(guò)對(duì)病毒3D RNA聚合酶的L123 F和G 64 R兩處氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行修飾，構(gòu)建高保真的 EV-A71 減毒株，接種該減毒株小鼠產(chǎn)生針對(duì)EV-A71的特異性中和抗體且未產(chǎn)生體質(zhì)量減輕、癱瘓、死亡等嚴(yán)重不良反應(yīng)。提示該減毒株具有較高的免疫原性及較低的毒力。密碼子去優(yōu)化是一種開(kāi)發(fā)安全穩(wěn)定的減毒**的新方法。

       3、病毒樣顆粒**

       病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）是由病毒單一或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白自行裝配而成的高度結(jié)構(gòu)化的蛋白質(zhì)顆粒，在形態(tài)特征和抗原性上與天然病毒顆粒相似，具備激發(fā)宿主免疫反應(yīng)的能力。VLP不含病毒基因組，不能自發(fā)復(fù)制感染，是構(gòu)建候選**的安全之選。

       基于制備脊髓灰質(zhì)炎病毒VLP**的經(jīng)驗(yàn)，可構(gòu)建昆蟲(chóng)細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，制備EV-A71B5亞型VLP**。該**能誘導(dǎo)恒河猴產(chǎn)生高水平的針對(duì)EV-A71不同亞型（B4、B5、C2和C4亞基因型）的特異性抗EV-A71病毒IgG和IgM，阻止EV-A71在恒河猴中傳播。除桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)外，EV-A71 VLP 還可以在酵母中產(chǎn)生，使用畢赤酵母表達(dá) EV-A71 VLP，能有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)同源和異源EV-A71株的中和抗體，還能通過(guò)母體免疫保護(hù)新生小鼠免于EV-A71攻擊。EV-A71 VLP**具有良好的保護(hù)效果，具較高安全性且易于制備，是優(yōu)質(zhì)的EV-A71候選**，但VLP**的生產(chǎn)成本較高，產(chǎn)量較低。

       4、重組VP1蛋白**

       病原體引起免疫反應(yīng)的主要成分是抗原蛋白上的抗原決定簇，抗原決定簇是由數(shù)量不等的抗原表位組成。EV-A71的主要抗原表位大多位于VP 1蛋白。將重組桿狀病毒Bac-Pie1-gp64-VP1轉(zhuǎn)入昆蟲(chóng)細(xì)胞后成功表達(dá)了C 4亞基因EV-A71的VP1，這種VP1蛋白與原始病毒VP1蛋白具有相同的形態(tài)結(jié)構(gòu)及免疫原性。小鼠接種這種重組蛋白后能產(chǎn)生高滴度的針對(duì)EV-A71病毒所有基因亞型的中和抗體。研究顯示，通過(guò)基因重組技術(shù)獲得包含gag蛋白（人免疫缺陷病毒結(jié)構(gòu)性多蛋白Pr 55 gag的前體蛋白）和EV-A71 VP 1 蛋白的VLP（gag-VP1 VLP）。這種**能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，還能通過(guò)母體免疫保護(hù)新生小鼠免受致命劑量EV-A71的攻擊。以上研究表明，重組VP1蛋白**能同時(shí)誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，并能對(duì)不同亞基因型的EV-A71產(chǎn)生交叉中和作用，具有較好的發(fā)展前景。但VP1蛋白**的保護(hù)作用仍需進(jìn)一步強(qiáng)化。

       5、合成肽**

       合成肽**是根據(jù)病原體抗原表位或者抗原決定簇氨基酸序列特點(diǎn)而開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)的一類(lèi)**。這種**通過(guò)人工合成病原微生物的保護(hù)性多肽或抗原表位，并輔以適當(dāng)?shù)妮d體與佐劑而制成的一種新型基因工程**。

       EV-A71 病毒上的多肽SP70位于VP 1 蛋白，是EV-A71的主要中和表位的重要組成之一。研究顯示，利用B4亞基因型EV-A71 的SP70免疫小鼠，小鼠可產(chǎn)生同原病毒免疫相似效價(jià)的特異性IgG，且能對(duì)B2、B5、C2、C4亞基因型病毒產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)?？筍P70血清能對(duì)同源及異源EV-A 71（B2、B4、B5、C2、C4）的攻擊提供較強(qiáng)的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，CV-A 16抗原表位PEP 71能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)同源和異源 CV-A 16 菌株的中和抗體；且CV-A 16 的SP70肽的氨基酸排列與PEP 71高度重疊，提示SP 70可能同樣具有開(kāi)發(fā)通用CV-A 16**的潛力?；诖搜芯浚瑢V-A71 VLP中的SP70肽替換為CV-A16 的SP 70 肽，設(shè)計(jì)一個(gè)嵌合的EV-A71 VLP（ChiEV-A 71 VLP）。這種**能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)EV-A71和CV-A16的特異性體液免疫，還能誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞IFN-c，IL-2，IL-4和IL-6顯著升高，激活小鼠針對(duì)EV-A71的有效細(xì)胞免疫應(yīng)答；小鼠注射抗ChiEV-A71血清后可在致死量的EV-A71和 CV-A16攻擊下存活。研究提示，抗ChiEV-A71血清能同時(shí)具有針對(duì)EV-A71和CV-A16感染的保護(hù)作用。合成肽**具有較高的特異性、較好的免疫原性和保護(hù)性。通過(guò)研究不同抗原肽的保護(hù)作用，并選擇不同抗原肽嵌合腸道病毒VLP制備**的方法可能是制備多價(jià)HFMD**的新思路。

       EV-A 71 是最 具致病性的腸道病毒之一，雖然我國(guó)研發(fā)的EV-A 71滅活**已批準(zhǔn)上市，但該**仍需進(jìn)行進(jìn)一步的遠(yuǎn)期評(píng)估。同時(shí)也要繼續(xù)深入研究減毒活**，病毒樣顆粒**、重組VP1蛋白**、合成多肽**等新型**，需在保證**安全性的前提下，進(jìn)一步提高其保護(hù)效力及生產(chǎn)能力。同時(shí)，除EV-A71以外，CV-A16和近年來(lái)新興的腸道病毒如CV-A6、CV-A8和CV-A10等也與HFMD的暴發(fā)有關(guān)。因此研制預(yù)防多種腸道病毒感染的聯(lián)合**將是預(yù)防HFMD**的重要研究方向。

       參考資料

       [1]畢方川,許紅梅.腸道病毒71型**研究進(jìn)展[J].臨床兒科雜志,2021,39(05):391-395.

       [2]湯華萍.國(guó)產(chǎn)腸道病毒71型**上市后免疫效果、安全性、接種意愿及其免疫策略研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥,2021,16(23):201-203.

       作者簡(jiǎn)介：小米蟲(chóng)，藥品質(zhì)量研究工作者，長(zhǎng)期致力于藥品質(zhì)量研究及藥品分析方法驗(yàn)證工作，現(xiàn)就職于國(guó)內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事藥品檢驗(yàn)分析及分析方法驗(yàn)證