近年來，核酸類藥物因?yàn)樵O(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、研發(fā)周期短、成功率高、特異性強(qiáng)、能夠在根本上調(diào)控致病基因等優(yōu)勢(shì)，成為眾多難治疾病治療方案的研究熱點(diǎn)。不過核酸類藥物自身也存在一些問題，如體內(nèi)穩(wěn)定性差，容易被體內(nèi)的核酸酶降解或被腎臟清除；核酸類藥物本身分子量大且?guī)в胸?fù)電荷，難以跨越細(xì)胞膜到達(dá)胞內(nèi)來發(fā)揮作用；核酸類藥物在體內(nèi)的靶向性弱，不能精準(zhǔn)靶向目標(biāo)細(xì)胞或組織，可能會(huì)在實(shí)際應(yīng)用中產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，導(dǎo)致副作用從而損傷機(jī)體，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物還會(huì)面臨被溶酶體水解的風(fēng)險(xiǎn)，以及在循環(huán)過程中非特異性吸附蛋白而無法發(fā)揮作用等。因此，除通過化學(xué)修飾改善核酸穩(wěn)定性和免疫原性外，還需為其提供高效安全的體內(nèi)遞送系統(tǒng)。當(dāng)前核酸藥物開發(fā)可分為化學(xué)改造和物理改性兩大方向，二者可單獨(dú)或共同提升核酸藥物體內(nèi)外穩(wěn)定性和特定組織、細(xì)胞內(nèi)的翻譯效率。目前已開發(fā)出多種核酸改造和遞送技術(shù)，主要包括化學(xué)修飾、配體偶聯(lián)和納米遞送載體。

       化學(xué)修飾

       核酸化學(xué)修飾廣泛用于ASO、siRNA、miRNA、mRNA等核酸類藥物，有助于核酸類藥物在疾病治療中發(fā)揮作用。對(duì)核酸類藥物進(jìn)行修飾能夠提高其抗酶解能力，保持序列的穩(wěn)定性并延長(zhǎng)半衰期，可以增加藥物的脂溶性，降低免疫原性。同時(shí)，化學(xué)修飾可以提高靶向性，如在核酸序列的末端引入細(xì)胞表面特異性識(shí)別的配體或適配體，提高核酸類藥物的沉默效率和催化反應(yīng)效率等。

       1、磷酸基團(tuán)修飾

       磷酸基團(tuán)的修飾常在非橋連氧原子上進(jìn)行，應(yīng)用較為廣泛的是硫原子取代磷酸基團(tuán)的一個(gè)非橋連氧原子，從而形成硫代磷酸酯鍵。硫代磷酸酯鍵有利于提高核酸的抗酶解能力和與血漿蛋白的結(jié)合能力，從而延長(zhǎng)其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。然而，硫代修飾的不足之處在于其與靶序列的結(jié)合力較弱，且高含量的硫代磷酸酯鍵可能帶來細(xì)胞毒性和免疫刺激等副作用。因此，硫代磷酸酯鍵的位置和數(shù)量對(duì)于遞送效率也很重要。此外，磷酸基團(tuán)上的氧原子還可被各種胺基、硼 烷基取代，或整個(gè)磷酸基被酰胺基、胺氧基、烷氧基、三氮唑基等取代，但這些應(yīng)用均不如硫代修飾普遍。

       2、堿基修飾

       對(duì)堿基的修飾主要為堿基的取代基修飾或堿基的替換，嘧啶的5-位和嘌呤的8-位是常用的取代位點(diǎn)。常用的堿基修飾類型有假尿苷、2-硫尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、N6-甲基腺苷、5-甲基胞苷等。其中用假尿苷代替尿嘧啶是常見的堿基修飾之一。研究證明，替換成假尿苷可改善編碼Cas9 的 mRNA 的翻譯并降低其免疫原性。此外，N-乙基哌啶-6-三唑修飾的腺苷類似物可以阻礙siRNA 與Toll樣受體8的相互作用，降低免疫原性。6'-苯基吡 咯胞嘧啶是一種胞嘧啶類似物，具有良好的堿基配對(duì)效應(yīng)、熱穩(wěn)定性和強(qiáng)熒光性。siRNA 經(jīng) 6'-苯基吡 咯胞嘧啶修飾后其基因沉默效果不受影響，且其熒光特性可用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) siRNA 的攝取和運(yùn)輸。

       3、核糖修飾

       核糖修飾主要有兩種類型，一種是在其 2' 位引入不同大小和極性的基團(tuán)，常見的有 2'-甲氧基、2'-甲氧基乙氧基和 2'-脫氧-2'-氟等；另一種是在 2' 位及其他核糖位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行修飾，如鎖核酸 (locked nucleic acid，LNA)、肽核酸 (peptide nucleic acid，PNA) 和磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸 (phosphoramidite morpholino oligonucleotides，PMO) 等。2'位修飾對(duì)于抑制核酸酶的水解很重要。2'-甲氧基修飾是目前應(yīng)用較廣泛的核糖修飾手段，可以增強(qiáng)藥物與靶 mRNA 的結(jié)合性、抑制核酸酶的水解、減弱體內(nèi)免疫原性，并賦予核酸結(jié)構(gòu)一定的脂溶性。2'-甲氧基乙氧基是 2'-甲氧基的類似物，具有相似的性質(zhì)，但對(duì)靶 mRNA 的親和力和抗酶解能力更強(qiáng)。2'-脫氧-2'-氟修飾可以提高 siRNA 的親和力和穩(wěn)定性。在核糖的2'、4'位甚至整個(gè)糖環(huán)進(jìn)行修飾也會(huì)產(chǎn)生較好的效果。

       鎖核酸是一種核酸構(gòu)象的限制性修飾，采用 C3'-內(nèi)切構(gòu)象，其可以僅用較短的序列來保持較高的靶親和力和抗酶解能力。但短序列的鎖核酸的脫靶效應(yīng)和毒性問題較為嚴(yán)重，因此實(shí)際應(yīng)用中常采用解鎖核酸、限制性乙基橋核酸、三環(huán) DNA、乙二醇核酸來替代，并且將這四種核糖修飾與硫代磷酸酯修飾組合運(yùn)用可以獲得更好的治療效果。PMO和肽核酸修飾帶來的電中性結(jié)構(gòu)可以提高核酸類藥物的穩(wěn)定性和親和力。PMO 的水溶性較好，應(yīng)用較為廣泛，目前一些 PMO 修飾的 siRNA 和miRNA 已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。PMO 還可以進(jìn)一步修飾，如引入穿膜肽和帶正電性的胺基，以提高其跨膜能力。

       偶聯(lián)配體

       核酸藥物可通過共價(jià)偶聯(lián)脂質(zhì)、半乳糖、蛋白/多肽或適配體等來延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，增加在特定組織和細(xì)胞的蓄積與攝取。利用特定的偶聯(lián)配體不但能調(diào)節(jié)核酸藥物與血漿蛋白的結(jié)合，改善藥物的組織分布，還能通過配體靶向細(xì)胞表面受體實(shí)現(xiàn)特定組織或細(xì)胞的遞送。同時(shí)，還可通過設(shè)計(jì)配體與核酸藥物之間的連接鍵，如采用酸敏感的酰胺鍵、在胞質(zhì)中易被還原斷開的二硫鍵或 Dicer 敏感鍵等，使核酸藥物在進(jìn)入特定生理環(huán)境后與偶聯(lián)物分離，有效適應(yīng)特定的治療機(jī)制。

       1、脂質(zhì)偶聯(lián)

       寡核苷酸共價(jià)結(jié)合脂質(zhì)及其衍生物形成的綴合物可增強(qiáng)寡核苷酸的體內(nèi)遞送效率。如在3'末端共價(jià)鍵合膽固醇的siRNA可有效沉默肌肉生長(zhǎng)抑素誘導(dǎo)肌肉生長(zhǎng)，共價(jià)鍵合α-生育酚的siRNA可沉默小鼠肝臟中ApoB。偶聯(lián)膽固醇的RNA可通過與高密度脂蛋白 (high-density lipopro‐tein，HDL)或低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL) 的預(yù)組裝，可增加特定組織和細(xì)胞的攝取，改變siRNA 的分布。與游離siRNA-膽固醇相比，和HDL預(yù)組裝的 siRNA-膽固醇(HDL siRNA) 可在肝臟和空腸中產(chǎn)生更強(qiáng)的沉默效應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與 LDL預(yù)組裝的siRNA-膽固醇(LDL siRNA)顆粒幾乎只在肝臟中吸收，而HDL siRNA 顆粒主要由肝臟、腎上腺、卵巢、腎臟和小腸吸收。因此，研究者提出 siRNA-膽固醇的內(nèi)吞作用分別由HDL和LDL相關(guān)的B類I型清道夫受體和LDL受體介導(dǎo)。還有研究發(fā)現(xiàn)siRNA-脂質(zhì)綴合物與不同類別脂蛋白的體內(nèi)結(jié)合效力受其疏水性影響，疏水性更強(qiáng)的綴合物優(yōu)先結(jié)合LDL，而疏水性弱的綴合物優(yōu)先結(jié)合HDL。因此可以通過偶聯(lián)不同疏水性的脂質(zhì)實(shí)現(xiàn) RNA 藥物在不同組織的靶向遞送。

       2、N-乙酰氨基半乳糖 (N-acetylgalactosamine，GalNAc) 偶聯(lián)

       GalNAc是一種與去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPR) 高度親和的二糖類化合物。ASGPR在肝臟中高度特異性表達(dá)，采用GalNAc偶聯(lián)的RNA藥物有望實(shí)現(xiàn)肝臟的高效特異性遞送。2019年，第1個(gè)靶向δ-氨基乙酰丙酸合酶1的GalNAc偶聯(lián)siRNA藥物Givosiran 獲批用于治療急性間歇性卟啉癥患者。2020年底，兩種GalNAc偶聯(lián)siRNA 藥物lumasiran 和inclisiran 也分別獲批臨床使用。Lumasiran 是一種用于治療1型原發(fā)性高草酸尿癥的siRNA 藥物，可降低肝細(xì)胞中羥基酸氧化酶1的mRNA的翻譯。Inclisiran是一種用于治療動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的 siRNA藥物，可降低前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型的mRNA 的翻譯。然而ASGPR只在高度分化的肝細(xì)胞中高表達(dá)，而在低度分化的肝癌細(xì)胞系中表達(dá)水平較低，GalNAc 偶聯(lián)用于肝癌治療的策略仍有待改進(jìn)。此外，由于肝外組織缺乏ASGPR 的表達(dá)，尚無法通過GalNAc 偶聯(lián)技術(shù)實(shí)現(xiàn)高效的 RNA 藥物遞送。

       3、多肽偶聯(lián)

       細(xì)胞穿透肽 (cell penetrating peptide，CPP) 一般是由5～30個(gè)氨基酸組成的兩親性或陽離子肽片段，包括HIV-1 (human immunodeficiency virus-1)反式激活因子 (HIV-Tat)、果蠅的觸角足同源異形域的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域第 3 片段 (peneytatin 1)、由神經(jīng)肽甘丙肽和乳突蛋白合成的嵌合肽 (transportan) 或基于堿性氨基酸 (如精氨酸和賴氨酸) 的聚合物等。CPP 與負(fù)電核酸或電中性的改造核酸偶聯(lián)后，可增加偶聯(lián)物整體的正電性，促進(jìn)核酸的細(xì)胞攝取。當(dāng)前已有多個(gè)多肽-PMO (peptide-PMO， PPMO) 綴合物處于臨床前研究階段。PPMO M23D-B能增強(qiáng)肌營養(yǎng)不良蛋白外顯子 23 的跳躍，實(shí)現(xiàn)疾病模型小鼠肌肉中肌營養(yǎng)不良蛋白的持續(xù)表達(dá)，富含精氨酸的 Pip6a 肽與 PMO的綴合物 (Pip6a-PMO) 可直接攜帶核酸進(jìn)入脊髓性肌萎縮模型動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過靶向CUG 重復(fù)擴(kuò)增的轉(zhuǎn)錄本，增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活蛋白的表達(dá)，治療I型強(qiáng)直性營養(yǎng)不良(myotonic dystrophy 1，DM1)。除CPP 外，靶向胰高血糖素樣肽1受體 (glucagonlike peptide 1 receptor，GLP1R) 的GLP1 樣肽和多價(jià)環(huán)狀精甘天冬氨酸肽(cyclic arginylglycylaspartic acid，cRGD) 也已證明可介導(dǎo)RNA 遞送。研究者將由40個(gè)氨基酸構(gòu)成的GLP1樣肽修飾于ASO羧基末端，可在胰島β細(xì)胞中沉默靶基因。cRGD 修飾的siRNA可特異性遞送至高表達(dá)αvβ3 整合素的黑色素瘤細(xì)胞，敲低靶基因。上述研究表明多肽偶聯(lián)可改善 RNA 的組織分布和細(xì)胞攝取。不過，多肽與 RNA之間也可能因異種電荷而相互吸引而導(dǎo)致團(tuán)聚，進(jìn)而影響RNA 的遞送效力。

       4、抗體/適配體偶聯(lián)

       目前已有3種非結(jié)合型 PMO藥物eteplirsen、golodirsen和viltolarsen 獲批用于治療杜氏肌營養(yǎng)不良癥，然而，其改善肌肉的效果仍有待提高。研究者嘗試通過受體介導(dǎo)的方法增強(qiáng)用于肌肉疾病的寡核苷酸藥物遞送，如偶聯(lián)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 (trans‐ferrin receptor，TfR) 的抗體加強(qiáng)肌肉組織遞送效率。TfR作為鐵結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白的主要入口，在高代謝活性的骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腦內(nèi)皮細(xì)胞和增殖性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，可在網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)下將偶聯(lián)物內(nèi)化。通過此途徑，TfR 能促使 siRNA-抗體/適配體偶聯(lián)物進(jìn)入肌肉或跨越血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，沉默特定基因的表達(dá)?；谑荏w-配體的相互作用，已有多種受體被證實(shí)可提高 siRNA和ASO 的靶向遞送效率，包括人類表皮生長(zhǎng)因子受體2、T 細(xì)胞標(biāo)記物 CD7、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 CD71、CD44、A 型肝配蛋白受體-2 和表皮生長(zhǎng)因子受體等。

       核酸適配體是長(zhǎng)度為20～100 nt的單鏈DNA或RNA， 能形成特定且穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)，從而與靶分子高特異性穩(wěn)定結(jié)合，因此也被稱為"化學(xué)抗體"。相較于蛋白抗體，核酸適配體制造簡(jiǎn)單、成本低廉、尺寸小、免疫原性低。通過將核酸適配體與特定 RNA 藥物偶聯(lián)，可增強(qiáng)目標(biāo) RNA 的體內(nèi)靶向遞送。前列腺特異性抗原 (prostate specific membrane antigen，PSMA) 適配體A10是第一代靶向 PSMA 陽性細(xì)胞的核酸適配體。經(jīng)A10偶聯(lián)的siRNA可顯著抑制PSMA陽性細(xì)胞內(nèi) PLK1 和 BCL2 基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)核纖層蛋白A/C基因沉默。類似地，gp120的RNA 適配體可通過由2'-OMe 和2'氟嘧啶修飾的富含GC 序列的核酸短鏈結(jié)構(gòu)連接 siRNA 形成復(fù)合物，抑制模型小鼠體內(nèi)的 HIV-1復(fù)制。

未完待續(xù)！

       參考資料

       [1]李丹，黃宇坤，高小玲.RNA藥物遞送研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2023，58(03)

       [2]王峻峰，譚曼曼，王穎等.核酸類藥物的修飾和遞送研究進(jìn)展[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2023，52(04)       

       作者簡(jiǎn)介：小米蟲，藥品質(zhì)量研究工作者，長(zhǎng)期致力于藥品質(zhì)量研究及藥品分析方法驗(yàn)證工作，現(xiàn)就職于國內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事藥品檢驗(yàn)分析及分析方法驗(yàn)證。