為保證用藥安全，注射劑必須采用無菌生產(chǎn)工藝并保證最終藥品完全符合藥典的相關(guān)要求，因此，注射劑除應(yīng)符合制劑的一般要求外，還必須符合藥典規(guī)定的無熱原質(zhì)量要求：無熱原，特別是用量一次超過5ml以上、供靜脈注射或脊椎注射的注射劑，熱原檢查必須符合藥典的有關(guān)規(guī)定。

       熱原是指能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質(zhì)，通俗來講，熱原主要來源于細(xì)菌死亡后的包涵體釋放物。無菌注射制劑的最終給藥方式一般為靜脈注射，當(dāng)注射的藥液中含有熱原時(shí)，很可能會發(fā)生熱原反應(yīng)。熱原反應(yīng)的主要表現(xiàn)為輸液過程中或輸液后，患者出現(xiàn)發(fā)冷、寒戰(zhàn)、面色蒼白、四肢冰冷，繼之出現(xiàn)高熱，體溫可達(dá)40℃小時(shí)以上，嚴(yán)重時(shí)可伴有惡心嘔吐、頭痛、四肢關(guān)節(jié)痛、皮膚灰白色、血壓下降、昏迷休克甚至危及生命。一般注入人體的注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素含量達(dá)1μg/kg 就可致熱原反應(yīng)。

       熱原包括細(xì)菌性熱原、內(nèi)源性高分子熱原、內(nèi)源性低分子熱原及化學(xué)熱原等。細(xì)菌性熱原是指某些細(xì)菌的代謝產(chǎn)物、細(xì)菌尸體及內(nèi)毒素。致熱能力最強(qiáng)的是革蘭氏陰性桿菌的產(chǎn)物，其次是革蘭陽性桿菌類，革蘭陽性球菌則較弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能產(chǎn)生熱原。細(xì)菌內(nèi)毒素可以和活的微生物連接，也可以是死的微生物裂片，或者是游離的分子。游離內(nèi)毒素可以從細(xì)胞表面或從制藥用水系統(tǒng)生成的生物膜釋放出來，或者從原料進(jìn)入制藥用水或無菌配液系統(tǒng)。

       細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的一種脂多糖和微量蛋白的復(fù)合物，它的特殊性不是細(xì)菌或細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，而是細(xì)菌死亡或解體后才釋放出來的一種具有內(nèi)毒素生物活性的物質(zhì)。細(xì)菌內(nèi)毒素的量可用內(nèi)毒素單位（EU）表示，1EU與1 IU（內(nèi)毒素國際單位）相當(dāng)。

       內(nèi)毒素屬于熱原的一種，但熱原不全是內(nèi)毒素。歐洲藥典委員會曾提出："嚴(yán)格地講，不是每一種熱原都具有脂多糖的結(jié)構(gòu)，但所有已知的細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖都有熱原活性"。由此可見，熱原與細(xì)菌內(nèi)毒素兩者之間既有許多相同之處，但還是有區(qū)別的。熱原與細(xì)菌內(nèi)毒素均有相應(yīng)的檢測方法。熱原檢查法是將一定劑量的供試品通過靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定的一種方法。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是指利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。

       細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法具有較家兔熱原檢查法靈敏、快速、簡便易行、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，目前細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法已廣泛應(yīng)用于西藥和生物制品等。但同時(shí)也應(yīng)該指出，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是一個(gè)復(fù)雜的酶促反應(yīng)過程，生產(chǎn)工藝的細(xì)微變化都可能引起其干擾的增加。中藥注射劑因成分復(fù)雜、影響因素多等特點(diǎn)，一般還是采用傳統(tǒng)的家兔熱原檢查法，但是對一些具有解毒降溫作用的藥物，因會干擾家兔的生理活性，引起體溫下降，用家兔法檢測可能不準(zhǔn)，還是應(yīng)考慮用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。

       細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，供試品在進(jìn)行檢測時(shí)，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)測定結(jié)果有爭議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。凝膠法是指通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來檢測或半定量內(nèi)毒素的方法。光度測定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法兩種，濁度法是指利用檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化而測定內(nèi)毒素含量的方法；顯色基質(zhì)法是指利用檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出顯色團(tuán)的多少面測定內(nèi)毒素含量的方法。

       在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查過程中，應(yīng)防止微生物和內(nèi)毒素的污染。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水是指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝膠法）或0.005EU/ml（用于光度測定法）且對內(nèi)毒素試驗(yàn)無干擾作用的滅菌注射用水；所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素，耐熱器皿常用干熱滅菌法（250℃ 30分鐘以上）去除，也可采用其他確認(rèn)不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法，若使用塑料器械（如微孔板和微量加樣器配套的吸頭等）應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)毒素并且對試驗(yàn)無干擾的器械。

       藥品與生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值一般按L=K/M進(jìn)行確定，式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性單位）表示；K為人每千克體重每小時(shí)可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/（kgoh）表示，注射劑K=5 EU/（kgoh）；**藥品注射劑K=2.5 EU/（kgoh）；鞘內(nèi)用注射劑K=0.2 EU/（kgoh）；M為人用每千克體重每小時(shí)的供試品劑量，以ml/（kgoh）、mg/（kgoh）或U/（kgoh）表示，人均體重按60kg計(jì)算，人均表面積按1.62m2計(jì)算。注射時(shí)間若不足1小時(shí)，按1小時(shí)計(jì)算，供試品每平方米體表面積劑量乘以0.027即可轉(zhuǎn)換為每千克體重劑量（M）。

       與無菌產(chǎn)品的微生物限度不同，注射劑產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值并非為零，在無菌注射劑的生產(chǎn)過程中，需采用各種有效手段控制最終產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素的水平。不同注射劑產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值各不相同，例如，鹽酸**注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值為0.20EU/ml，滅菌注射用水的細(xì)菌內(nèi)毒素限值為0.25EU/ml，而氯化鈉注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值為0.50EU/ml。細(xì)菌內(nèi)毒素限值沒有考慮到幾個(gè)藥物聯(lián)合用藥問題，但一般情況下，藥品中內(nèi)毒素的含量要遠(yuǎn)低于限值，并且藥品生產(chǎn)廠家的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)要嚴(yán)于注冊標(biāo)準(zhǔn)，所以藥典內(nèi)毒素限值也被稱為允許內(nèi)毒素濃度。

       細(xì)菌內(nèi)毒素的性質(zhì)主要包括如下幾個(gè)方面：（a）細(xì)菌內(nèi)毒素能溶于水，以水為溶劑的注射劑要采取措施除去細(xì)菌內(nèi)毒素；（b）細(xì)菌內(nèi)毒素體積小，約為1~5 nm之間，故可通過超濾膜或反滲透膜進(jìn)行去除；活性炭對細(xì)菌內(nèi)毒素有吸附作用，可以濾除細(xì)菌內(nèi)毒素；（c）內(nèi)毒素本身不揮發(fā)，但因具有水溶性，蒸餾時(shí)可隨著水蒸氣霧滴進(jìn)入蒸餾水中；（d）細(xì)菌內(nèi)毒素非常耐熱，60℃加熱1小時(shí)不受影響，100℃時(shí)大多數(shù)也不會發(fā)生熱解，180℃ 3~4小時(shí)，250℃ 30~45分鐘或650℃ 1分鐘才可徹底破壞細(xì)菌內(nèi)毒素，一般注射劑的滅菌條件，不能徹底破壞細(xì)菌內(nèi)毒素；（e）細(xì)菌內(nèi)毒素能被強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、強(qiáng)氧化劑、超聲波等破壞，粒子交換樹脂能吸附細(xì)菌內(nèi)毒素。

       熱原的處理方法主要包括滅活法與分離法兩大類。滅活法主要包括干熱滅菌法、酸處理、堿處理、氧化劑處理和烷化劑處理等，例如采用干熱滅菌柜在250℃ 30min以上可以焚化細(xì)菌內(nèi)毒素，或在線清洗工作站采用2%堿液循環(huán)清洗去除制藥配液系統(tǒng)中的細(xì)菌內(nèi)毒素等；分離法主要包含吸附法、膜分離法和蒸餾法等，例如，制備純化水時(shí)控制細(xì)菌內(nèi)毒素的方法主要包括活性炭吸附、超濾、反滲透與蒸餾等工藝，而在注射用水的制備過程中，吸附法、膜分離法和蒸餾法現(xiàn)已被成熟應(yīng)用于去除原水中的細(xì)菌內(nèi)毒素。

       （1）吸附法 吸附法可以有效地去除熱原，常用的吸附材料有活性炭、陰離子交換樹脂、硫酸鋇、石棉等。美國藥典收載了活性炭、大分子陰離子交換樹脂去除熱原的方法，在純化水制備工藝中，活性炭吸附是去除熱原最常采用的方法，它通常要與薄膜過濾器聯(lián)合使用，以防止活性炭進(jìn)入下道工序；若原水中細(xì)菌內(nèi)毒素污染程度較低時(shí)，使用大分子陰離子交換樹脂去除熱原的方法比較適用。

       （2）膜分離法 超濾、微孔膜過濾和反滲透均屬于膜分離技術(shù)，它們之間各有分工，但并不存在明顯的界限，超濾膜孔徑大的一端與微孔濾膜相重疊，孔徑小的一端與反滲透相重疊。美國藥典與日本藥典將反滲透與超濾結(jié)合的方法作為注射用水的法定生產(chǎn)方法，同時(shí)，歐盟藥典已通過決議允許膜過濾法應(yīng)用于注射用水的制備，并將于2017年4月開始正式實(shí)施，意味著膜分離技術(shù)在去除熱原方面的成熟。反滲透、超濾、微孔膜過濾有其相似之處，它們都是在壓差的驅(qū)動下，利用膜的特定性能將水中離子、分子、膠體、熱原、微生物等微粒分離，但它們分離的機(jī)理及對象有所不同。

       反滲透膜的孔徑最小，按其阻滯污染物（包括熱原）的分子量大小計(jì)，一般在100～200之間。由于熱原的分子量在50000以上，其直徑大小一般在1～50μm之間，因此能被有效去除。反滲透膜只允許1nm以下的無機(jī)離子為其主要分離對象，故有良好的除鹽作用，而超濾、微孔膜過濾并無除鹽性能。

       微孔膜過濾有某種去除熱原的功效，它利用篩分、靜電吸附和架橋原理攔截直徑比較大的那一部分熱原物質(zhì)，應(yīng)當(dāng)指出，這種去除是很不完全的，直徑比較小的熱原物質(zhì)會通過0.22μm的微孔濾膜，微小的熱原可以透過0.025μm的濾膜，最小的熱原體甚至可以穿透所有的微孔濾膜。由于熱原分子量越大，致熱作用就越強(qiáng)，因此利用微孔濾膜進(jìn)行除菌過濾時(shí)，客觀上可能會起到某些截留熱原的積極作用，但它不能作為去除熱原的可靠方法而單獨(dú)使用，因此，企業(yè)需要在生產(chǎn)過程中控制細(xì)菌內(nèi)毒素指標(biāo)符合藥典的限定要求。

       從非勻質(zhì)超濾膜電子掃描圖可以看到，超濾的過濾介質(zhì)具有類似篩網(wǎng)的結(jié)構(gòu)，而過濾僅發(fā)生在濾膜的表面。與反滲透不同，超濾主要靠機(jī)械法分離內(nèi)毒素，超濾過程同時(shí)發(fā)生三種情況：分離物被吸附滯留、被阻塞或被截留在膜的表面并實(shí)現(xiàn)篩分。超濾膜的孔徑大致在0.005～1μm之間，細(xì)菌的大小在0.2～800μm之間，因此用超濾膜可去除細(xì)菌。然而，對人體致熱原效應(yīng)的熱原分子量為80萬～100萬，自然存在的熱原群體是一個(gè)混合體，小的一端僅為1～3μm，因此，用以截留熱原的超濾膜的分子量級需達(dá)到1萬～8萬方能有效去除熱原。超濾與微孔過濾的方式不同，微孔膜過濾為靜態(tài)過濾，將溶液攪拌，以消除濃差極化層，超濾則為動態(tài)過濾，濾膜表面不斷受到流動溶液的沖刷，故不易形成濃差極化層。

       （3）蒸餾法 由于細(xì)菌內(nèi)毒素不具有揮發(fā)性，蒸餾法一直是制備注射用水最有效、最安全與最普及的方法，蒸餾是采用氣液相變法和物理分離法的原理對原料水進(jìn)行化學(xué)和微生物純化的工藝過程，通過蒸餾法至少能減少原料水中99.99%的內(nèi)毒素含量。

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       9. 良好自動化生產(chǎn)實(shí)踐指南（第五版）

       專家簡介：張功臣，制藥行業(yè)專家，主要從事制藥流體與生物工藝系統(tǒng)的研究與實(shí)踐，全國制藥工程設(shè)計(jì)競賽委員會專家，ISPE培訓(xùn)專家，國家藥監(jiān)局檢查員培訓(xùn)專家，國家標(biāo)準(zhǔn)《GB50913-2013 醫(yī)藥工藝用水系統(tǒng)設(shè)計(jì)規(guī)范》編委。

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