非標記藥物靶標發(fā)現(xiàn)技術，助力新藥研發(fā)

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作者：云天來源：CPHI制藥在線

2024-07-08

非標記方法已經(jīng)成為探索小分子靶點識別的重要技術，尤其適用于結構修飾受限的天然小分子化合物。非標記藥物靶標發(fā)現(xiàn)技術聚焦于小分子結合后引發(fā)的靶蛋白穩(wěn)定性變化，如熱穩(wěn)定性、抗水解能力或化學穩(wěn)定性的變化。通過先進的蛋白質組學分析策略，能夠精準捕捉這些微妙變化，進而揭示出隱藏的靶蛋白身份。具體而言，非標記靶點鑒定工具箱中包含了諸如DARTS（藥物親和響應靶標穩(wěn)定性分析）、SPROX（基于氧化速率的蛋白質穩(wěn)定性評估）以及CETSA（細胞熱位移分析）或TPP（熱蛋白質組學分析）等先進技術。這些方法各有千秋，通過不同機制監(jiān)測蛋白質在小分子結合后的穩(wěn)定性變化，為藥物作用機制的闡明及新靶點的發(fā)現(xiàn)提供了新穎且高效的途徑。這些技術的融合應用，拓寬了靶點鑒定的邊界，也為藥物研發(fā)領域的創(chuàng)新注入了新的活力。

非標記藥物靶標發(fā)現(xiàn)技術

圖一非標記藥物靶標發(fā)現(xiàn)技術

1.DARTS（藥物親和響應靶標穩(wěn)定性分析）

2009年，Lomenick團隊創(chuàng)新性地推出了DARTS技術，旨在精準定位小分子藥物的直接作用靶點。該技術基于一個關鍵發(fā)現(xiàn)：當藥物與靶蛋白緊密結合時，靶蛋白對蛋白酶的敏感性顯著降低，展現(xiàn)出增強的穩(wěn)定性與抗水解能力。實驗中，他們選用枯草桿菌蛋白酶作為工具，針對雷帕霉素與FK506的共同靶點FKBP12進行測試。結果顯示，F(xiàn)KBP12與這兩種藥物結合后，其抗蛋白酶水解能力顯著增強，有力證實了DARTS技術在靶點鑒定中的有效性和可靠性。尤為值得一提的是，DARTS方法無需對小分子化合物進行復雜的結構標記，大大拓寬了其應用范圍，展現(xiàn)出極高的普適性和實用性。

隨著DARTS技術的深入發(fā)展，其應用領域已經(jīng)拓展至天然產(chǎn)物的靶點鑒定。Morretta等研究表明，利用DARTS技術成功揭示了軟珊瑚屬Sinularia中分離的二萜5-epi-sinuleptolide作用于肌動蛋白Actin，通過干擾肌動蛋白骨架實現(xiàn)抗癌效果。Cai等則通過DARTS確認了樺木酸(BA)靶向葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)，激活內質網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡路徑。Wang等的研究進一步展示了DARTS在鑒定鹽霉素功能性靶點核仁素(NCL)中的作用，該靶點涉及抑制神經(jīng)母細胞瘤干細胞活性。為提升DARTS的蛋白質覆蓋率，研究人員將DARTS樣品與蛋白質質譜分析相結合，有效拓寬了靶點鑒定范圍。例如，隱丹參酮和牛蒡子苷元的靶點分別被鑒定為FK506結合蛋白1A(FKBP1A)和蛋白磷酸酶2A(PP2A)。盡管DARTS在天然產(chǎn)物靶點鑒定中展現(xiàn)出巨大潛力，但其對低豐度靶點的檢測能力受限，且靶蛋白水解敏感性和蛋白酶、細胞裂解液的選擇均可能影響技術效果，這些挑戰(zhàn)仍需進一步研究和優(yōu)化。

2、SPROX（基于氧化速率的蛋白質穩(wěn)定性評估）

SPROX技術基于過氧化氫誘導的甲硫氨酸氧化，在化學變性劑存在下，評估蛋白質的抗氧化穩(wěn)定性變化，以識別小分子化合物的蛋白質靶點。該方法涉及蛋白質樣品的折疊-去折疊平衡、甲硫氨酸氧化及后續(xù)定量分析。Dearmond等利用SPROX在酵母中鑒定了白藜蘆醇的多個靶點，包括細胞溶質醛脫氫酶和與翻譯相關的蛋白。Geer Wallace等則發(fā)現(xiàn)manassantin A通過靶向絲蛋白A和延伸因子1a抑制HIF-1a激活，展示其抗癌潛力。然而，SPROX受限于蛋白質中甲硫氨酸的低含量（約2.5%），且僅適用于細胞裂解物分析，不適用于活細胞系統(tǒng)，從而限制了其蛋白質組檢測范圍。

3、CETSA（細胞熱位移分析）或TPP（熱蛋白質組學分析）

CETSA（細胞熱轉換分析）技術通過加熱蛋白質樣品，評估其熱穩(wěn)定性變化來鑒定天然產(chǎn)物的靶蛋白。與天然產(chǎn)物結合的蛋白質在較高溫度下仍保持穩(wěn)定，而未結合者則降解或沉淀。CETSA適用于活細胞、細胞裂解液及組織樣品，通過蛋白質免疫印跡或蛋白質組學分析熔解曲線，計算Tm值來鑒定靶蛋白。盡管CETSA廣泛適用于多種樣品和蛋白質，但靈敏度有限且需高藥物濃度。TPP（MS-CETSA）技術進一步提升了CETSA的通量和靈敏度，通過TMT標記和LC-MS/MS分析識別靶點。CETSA及TPP在學術研究中展現(xiàn)了其鑒定天然產(chǎn)物靶點的潛力，如大麥芽堿的核磷蛋白靶點、抗瘧藥物的PfPNP靶點等。然而，CETSA及TPP也存在耗時、成本高及缺乏結構域結合信息的局限。盡管如此，CETSA技術在蛋白質種類和樣品類型上的廣泛應用范圍仍是其顯著優(yōu)勢。

小結

非標記方法在靶點識別中嶄露頭角，特別適用于天然小分子與靶蛋白的低親和力互作研究。這些技術通過監(jiān)測靶蛋白的穩(wěn)定性變化，利用先進的蛋白質組學技術，精準揭示隱藏靶點。DARTS、SPROX、CETSA及TPP等技術的互補應用，為藥物機制研究和新靶標發(fā)現(xiàn)提供了高效手段，同時促進了藥物研發(fā)領域的創(chuàng)新與發(fā)展。

參考文獻：

Label-Free Proteome Profiling as a Quantitative Target Identification Technique for Bioactive Small Molecules，Biochemistry.